Свп 3d крестики: Купить продукцию СВП 3D крестики Система Выравнивания плитки в Москве, Твери

30-дневная пробная версия.

Последнее обновление: 14 ноября 2020 года

3D-визуализация и метаболомное профилирование показывают более высокое содержание нейроактивного кавалактона в боковых корнях и корнях корончатого корня Piper methysticum (kava) | GigaScience

Аннотация

Общие сведения

Кава — важное нейроактивное лекарственное растение.Несмотря на то, что кава имеет большой глобальный потребительский след в связи с ее клиническим и рекреационным использованием, факторы, связанные с ее использованием, не имеют стандартизации, а тканеспецифический профиль метаболитов ее нейроактивных компонентов не совсем понятен.

Результаты

Здесь мы охарактеризовали метаболомный профиль и пространственно-временные характеристики тканей корней и стеблей, используя кросс-платформенную метаболомику и подход трехмерной визуализации. Газовая хроматография-масс-спектрометрия и жидкостная хроматография-масс-спектрометрия выявили наибольшее содержание кавалактонов в кожуре корневых и боковых корней. Визуализация с лазерной десорбцией и ионизацией электрораспылением (IR-MALDESI) с использованием инфракрасной матрицы выявила уникальное тканеспецифическое присутствие каждого целевого кавалактона. Анализ рентгеновской микрокомпьютерной томографии показал, что боковые корни имеют морфологические характеристики, подходящие для синтеза наивысшего содержания кавалактонов.

Выводы

Эти результаты предоставляют механистическое понимание социальной и клинической практики использования только очищенных корней, связывая конкретные характеристики тканей с концентрациями нейроактивных соединений.

Введение

Piper methysticum Forster f. это растение, произрастающее в Тихоокеанском регионе, а его корни и продукты широко известны как «кава» [1–3]. Кава пользуется большим спросом как лекарственное растение, известное своими анксиолитическими, седативными, психоактивными и успокаивающими свойствами при использовании в качестве рекреационного напитка, лечебных трав или пищевой добавки [2, 4, 5]. Кава — официальное лекарство, внесенное во многие фармакопеи, и используется в народной медицине на островах Тихого океана [3, 5–9].На протяжении более двух десятилетий культиваторы кавы и их существование на рынке продолжали сталкиваться с проблемами законодательных и производственных споров [4].

Биоактивные нейроактивные соединения кавы называются «кавалактонами», и они преимущественно присутствуют в корнях. Пути действия ферментов, которые влияют на биосинтез этих соединений, были идентифицированы и описаны Yang et al [10]. Новые димерные кавалактоны, а именно диянгонины (A – C), также были выделены из корней кавы [10, 11].Профили кавалактона генетически различаются между разновидностями. На основе хемотипов разновидности кавы классифицируются как «благородные», «лекарственные» или «двухдневные». Закон о каве 2002 года объявляет благородные разновидности кавы единственными легально культивируемыми разновидностями в Вануату, а малые информация о неблагородных сортах опубликована в литературе [12]. Независимо от сорта, содержание кавалактона может варьироваться в разных органах растения. Таким образом, жизненно важно установить тканеспецифические химические профили, которые могут помочь в выборе подходящего исходного сырья.

Традиционно для приготовления напитков использовали только очищенные корни [2]. Однако в батончиках кавы части растений (очищенные или неочищенные корень или стебли), разновидности (благородный или примесный неблагородный тип) и используемые концентрации остаются нерегулируемыми. Сырье, продаваемое на рынках, имеет форму предварительно нарезанных частей без указания используемых частей растений. Стебли и кожура стеблей — это дешевые примеси, используемые продавцами для замены дорогих корней кавы, и они непригодны для употребления.Стебли содержат высокое содержание пиперметистина и считаются гепатотоксичными, тогда как подходящие части растений (корни) не имеют высокого содержания пиперметистина [13]. Таким образом, крайне важно контролировать части и разновидности растений, которые имеют первостепенное значение среди множества факторов, влияющих на итоговое содержание кавалактона и фармакологические эффекты кавы [14, 15]. Насколько нам известно, ни в одном опубликованном исследовании не сообщалось о тканеспецифическом содержании кавалактона и профилях других вторичных метаболитов.

В настоящем исследовании мы впервые систематически исследуем метаболиты, обнаруженные в различных частях растения кавы. Мы расширяем предыдущую аналитическую работу, в которой использовались инструменты с более низкой чувствительностью и не проводилось различие между разными тканями [2, 16–21]. Мы тщательно контролируем разнообразие используемых растений и выбранных тканей и используем комбинацию метаболомики и технологии визуализации, чтобы получить наиболее подробную на сегодняшний день картину того, как метаболиты различаются в разных конкретных тканях растения.Эта работа представляет собой первоначальный взгляд на то, как социальные обычаи, такие как использование очищенных корней растения, могут быть связаны с измеримыми концентрациями метаболитов нейроактивных соединений.

Результаты

Профилирование на основе масс-спектрометрии позволяет выявить уникальные тканеспецифические профили метаболитов

В этом исследовании мы проанализировали очищенные и неочищенные корни и стебли на содержание в них кавалактона, чтобы установить количественные и качественные тканеспецифичные профили метаболитов. Использовались стебли и корни кавы благородного сорта со сроком созревания> 3 лет. Ткани корней и стеблей были выбраны для идентификации вторичных метаболитов с помощью жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС) и количественного определения кавалактонов с помощью газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС) для 3 отдельных отдельные растения (рис. 1). Пилинги корончатых корней (CRP), корневые корни без кожуры (CNP), корневые корни с кожурами (CWP), боковые корни (LR), кожуры стеблей (SP), стебли без кожуры (SNP) и стебли с кожурами (SWP ) были выбраны ткани для анализа.Количественный анализ с помощью ГХ-МС каваина, дигидрометистицина и десметоксиянгонина показал, что наибольшее содержание этих кавалактонов было обнаружено в LR, за которым следуют корневые корни и стебли (LR> корневые корни> стебли). Эта закономерность наблюдалась независимо от того, рассматривались ли отдельные группы тканей индивидуально (таблица 1).

Рисунок 1:

Определенные ткани корня и стебля кавы, выбранные для исследования, и применяемые статистические модели. Две смешанные линейные модели были изготовлены на основе выбора различных частей P.methysticum . CRP, CNP и LR обозначают кожицу корня коронки, коронку без кожуры и боковые корни. SP и SNP обозначают стебли кожуры и стебли без кожуры соответственно. Части растения делятся на стебли, корни кроны и боковые корни; таким образом, появилась модель для этих структурных местоположений с уровнями: стебель, боковой корень и корень коронки. Наконец, стебли и корневые корни были разделены на «кожуру» или «без кожуры», и мы использовали их, с боковыми корнями, как уровни для модели с термином для ткани (образцы стеблей и корончатых корней «с кожурой» были исключены. из смешанной линейной модели).

Рисунок 1:

Конкретные ткани корня и стебля кавы, выбранные для исследования, и применяемые статистические модели. Две смешанные линейные модели были сделаны на основе выбора различных частей P. methysticum . CRP, CNP и LR обозначают кожицу корня коронки, коронку без кожуры и боковые корни. SP и SNP обозначают стебли кожуры и стебли без кожуры соответственно. Части растения делятся на стебли, корни кроны и боковые корни; таким образом, появилась модель для этих структурных местоположений с уровнями: стебель, боковой корень и корень коронки.Наконец, стебли и корневые корни были разделены на «кожуру» или «без кожуры», и мы использовали их, с боковыми корнями, как уровни для модели с термином для ткани (образцы стеблей и корончатых корней «с кожурой» были исключены. из смешанной линейной модели).

Результаты количественного анализа выбранных лактонов кавы с помощью ГХ-МС в различных частях растения и отделенных тканях P. methysticum

Образец .	Каваин (мг / г ± стандартное отклонение) .	Дигидрометистицин (мг / г ± стандартное отклонение) .	Десметоксиянгонин (мг / г ± стандартное отклонение) .
CWP	0,425 ± 0,235	1,689 ± 0,862	0,355 ± 0,138
LR	2,003 ± 0,615	2,842 ± 0,748	0,901 ± 0,182
SWP	± 0,012	0. 290 ± 0,110	0,080 ± 0,015
CRP	0,987 ± 0,235	1,875 ± 0,467	0,660 ± 0,146
CNP	0,922 ± 0,187	2,055 ± 0,445	0,516 ± 0,088
SP	0,069 ± 0,021	0,500 ± 0,204	0,161 ± 0,044
SNP	0,128 ± 0,027	0,356 ± 0,067	0,165 ± 0,029

Образец .	Каваин (мг / г ± стандартное отклонение) .	Дигидрометистицин (мг / г ± стандартное отклонение) .	Десметоксиянгонин (мг / г ± стандартное отклонение) .
CWP	0,425 ± 0,235	1,689 ± 0,862	0,355 ± 0,138
LR	2,003 ± 0,615	2,842 ± 0,748	0,901 ± 0,182
SWP	± 0,012	0. 290 ± 0,110	0,080 ± 0,015
CRP	0,987 ± 0,235	1,875 ± 0,467	0,660 ± 0,146
CNP	0,922 ± 0,187	2,055 ± 0,445	0,516 ± 0,088
SP	0,069 ± 0,021	0,500 ± 0,204	0,161 ± 0,044
SNP	0,128 ± 0,027	0,356 ± 0,067	0,165 ± 0,029

Результаты количественного анализа отобранных лактонов кавы с помощью ГХ-МС в различных частях растений и отделенных тканях P.methysticum

Образец .	Каваин (мг / г ± стандартное отклонение) .	Дигидрометистицин (мг / г ± стандартное отклонение) .	Десметоксиянгонин (мг / г ± стандартное отклонение) .
CWP	0,425 ± 0,235	1,689 ± 0,862	0,355 ± 0,138
LR	2,003 ± 0,615	2,842 ± 0,748	0,901 ± 0. 182
SWP	0,042 ± 0,012	0,290 ± 0,110	0,080 ± 0,015
CRP	0,987 ± 0,235	1,875 ± 0,467	0,660 ± 0,146
CNP	0,922 ± 0,187	2,055 ± 0,445	0,516 ± 0,088
SP	0,069 ± 0,021	0,500 ± 0,204	0,161 ± 0,044
SNP	0.128 ± 0,027	0,356 ± 0,067	0,165 ± 0,029

Образец .	Каваин (мг / г ± стандартное отклонение) .	Дигидрометистицин (мг / г ± стандартное отклонение) .	Десметоксиянгонин (мг / г ± стандартное отклонение) .
CWP	0,425 ± 0,235	1,689 ± 0,862	0,355 ± 0,138
LR	2.003 ± 0,615	2,842 ± 0,748	0,901 ± 0,182
SWP	0,042 ± 0,012	0,290 ± 0,110	0,080 ± 0,015
CRP	0,987 ± 0,235	1,875 ± 0,467	0,660 ± 0,146
CNP	0,922 ± 0,187	2,055 ± 0,445	0,516 ± 0,088
SP	0,069 ± 0,021	0,500 ± 0,204	0. 161 ± 0,044
SNP	0,128 ± 0,027	0,356 ± 0,067	0,165 ± 0,029

Различные компоненты имели разный порядок концентрации в отдельных тканях и целых частях растения. Например, в целых корнях и стеблях содержание дигидрометистицина было выше по сравнению с каваином и десметоксиянгонином. А в отделенных тканях содержание дигидрометистицина было самым высоким в CNP, в отличие от каваина с самым высоким содержанием в CRP.

В дополнение к количественному анализу, мы также выполнили нецелевое профилирование метаболитов с помощью ГХ-МС, которое выявило присутствие 7 кавалактонов, 3 дигидрохалконов и 19 соединений, не относящихся к кава-лактону (рис. Рис. R1 и R2) [22]. Эти профили показали, что δ-кадинол и α-эпи-7-эпи-5-эудесмол отчетливо присутствуют во всех частях ткани боковых и корончатых корней. Пиперметистин и бензолпропаналь были обнаружены во всем стебле, а синильная кислота — только в SP.В целом было обнаружено, что корневые корни и LR имеют большее количество составляющих по сравнению со стеблями. За исключением вышеупомянутых различий в тканеспецифической встречаемости некоторых метаболитов, все другие метаболиты были обнаружены общими среди корневых корней, LR и стеблей.

Рисунок 2:

ГХ-МС-хроматограммы общих ионов различных частей корней P. methysticum . A , кожура корневых корней (CRP), B , корневые корни без кожуры (CNP), C , корневые корни с кожурой (CWP), и D , боковые корни (LR).Некоторые типичные кавалактоны и другие соединения, обнаруженные в экстрактах, обозначены как δ-кадинол (c), дигидрометистицин (d), α-эпи-7-эпи-5-эвдесмол (e), каваин (k) и десметоксиянгонин (y). .

Рисунок 2:

ГХ-МС хроматограммы общих ионов различных частей корней P. methysticum . A , кожура корневых корней (CRP), B , корневые корни без кожуры (CNP), C , корневые корни с кожурой (CWP), и D , боковые корни (LR). Некоторые типичные кавалактоны и другие соединения, обнаруженные в экстрактах, обозначены как δ-кадинол (c), дигидрометистицин (d), α-эпи-7-эпи-5-эвдесмол (e), каваин (k) и десметоксиянгонин (y). .

Также был проведен нецелевой ЖХ-МС анализ как в положительном, так и в отрицательном режиме, и предположительно были идентифицированы 14 кавалактонов, 3 дигидрохалкона и 19 соединений, не относящихся к кава-лактону (дополнительная таблица S2, репозиторий R3 – R6) [22]. Качественная ЖХ-МС показывает незначительные различия между присутствием вторичных метаболитов в положительном и отрицательном режимах ЖХ-МС. В положительном режиме ЖХ-МС было обнаружено 14 метаболитов, которые не были обнаружены в отрицательном режиме ЖХ-МС. Было обнаружено 12 соединений, обнаруженных в отрицательном режиме ЖХ-МС, которые не наблюдались в положительном режиме ЖХ-МС (дополнительная таблица S3).Между положительным и отрицательным режимами ионизации анализа ЖХ-МС было обнаружено 14 кавалактонов, 3 дигидрохалкона и 19 некавалактонов (дополнительная таблица S2). Обычными метаболитами, идентифицированными с помощью ГХ-МС и ЖХ-МС, были 6 кавалактонов (каваин, дигидрометистицин, дигидро-5,6-дегидрокаваин, дигидрокаваин, десметоксиянгонин и янгонин), 3 дигидрохалкона (флавокаваины A – кавалактоны) и 2 некавалактона. (борнил циннамат и пиперметистин).

Статистическое моделирование показывает, что корневые и боковые корни схожи по сигнатурам метаболитов, но сильно отличаются от стеблей

PCA1 отделяет оба корня от образца стебля

Мы провели ординацию PCA на 15 образцах из 5 тканей и рассмотрели результаты в структурной локации (красная стрелка, рис.1) и тканевого уровня (синяя стрелка, рис. 1). На уровне структурной локализации анализ главных компонентов (PCA) выявил полное разделение стеблей от обоих корневых корней и LR для GC-MS (рис. 3A) и LC-MS положительного (рис. 3B) и отрицательного режима (рис. 3C). . Кроме того, мы наблюдали разделение между корневыми корнями и LR для PCA1 отрицательных данных LC-MS (файл репозитория R10-1) и PCA7 положительных наборов данных LC-MS (файл репозитория R10-2) [22], хотя мы Можно ожидать, что это разделение было не таким сильным, как разделение между типами корней и стеблями, и наблюдалось не для всех методов спектрометрии.

Рисунок 3:

PCA и прямоугольные диаграммы для ГХ-МС и ЖХ-МС анализа корней и стеблей кавы. Графики PCA (A) GC-MS, (B) LC-MS положительный и (C) LC-MS отрицательный режим показывают четкое различие между корнями (зеленый) и стеблями (фиолетовый) для каждого набора данных . PCA1 разделил корни коронки, боковые корни и стебли с помощью скорректированных значений P парного теста Стьюдента t как (3.43E-05, 0,0003458) в (A) , (0.000475, 0,00257) в (B) и (0,000585, 0,00274) в (C) , соответственно. PCA1 также отделяет оба корня (треугольники) и боковые корни (круги) от стебля (квадраты). Смешанная линейная модель скорректированных значений P для PCA1 и PCA2 для ГХ-МС, ЖХ-МС положительного и отрицательного ЖХ-МС составляет 2,037E-06, 0,00206 и 2,137E-05 соответственно. Оси каждого графика показывают главные компоненты и процент объясненной ими дисперсии, округленный до ближайшего процента. (D) Kavain, (E) десметоксиянгонин и (F) дигидрометистицин, указанные на прямоугольных диаграммах, скорректировали значения P , равные 7,05E-06, 3,40E-06 и 7,05E-06 в смешанная линейная модель для разных типов тканей. Черные столбцы под прямоугольными графиками указывают на статистическую значимость скорректированных значений P из попарного теста Стьюдента t ; * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001. Значительные различия наблюдались между корнями (зеленые) и стеблями (пурпурные). CRP, CNP и LR обозначают кожицу корня коронки, коронку без кожуры и боковые корни соответственно. SP и SNP обозначают стебли кожуры и стебли без кожуры соответственно. Эти графики не включают целые секции ствола и кроны (SWP и CWP). Знак Δ обозначает корень короны, боковые корни обозначаются символом Ο, а символ stem обозначает стебли.

Рисунок 3:

PCA и прямоугольные диаграммы для анализа корней и стеблей кавы с помощью ГХ-МС и ЖХ-МС. Графики PCA (A) GC-MS, (B) LC-MS положительный и (C) LC-MS отрицательный режим показывают четкое различие между корнями (зеленый) и стеблями (фиолетовый) для каждого набора данных .PCA1 разделил корневые корни, боковые корни и стебли с помощью скорректированных значений P парного теста Стьюдента t как (3.43E-05, 0,0003458) в (A) , (0,000475, 0,00257) в (B) и (0,000585, 0,00274) в (C) соответственно. PCA1 также отделяет оба корня (треугольники) и боковые корни (круги) от стебля (квадраты). Смешанная линейная модель скорректированных значений P для PCA1 и PCA2 в ГХ-МС, положительном ЖХ-МС и отрицательном режиме ЖХ-МС равняется 2.037E-06, 0.00206 и 2.137E-05 соответственно. Оси каждого графика показывают главные компоненты и процент объясненной ими дисперсии, округленный до ближайшего процента. (D) Kavain, (E) десметоксиянгонин и (F) дигидрометистицин, указанные на прямоугольных диаграммах, скорректировали значения P , равные 7,05E-06, 3,40E-06 и 7,05E-06 в смешанная линейная модель для разных типов тканей. Черные столбцы под прямоугольными графиками указывают на статистическую значимость скорректированных значений P из попарного теста Стьюдента t ; * P ≤ 0.05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001. Значительные различия наблюдались между корнями (зеленые) и стеблями (пурпурные). CRP, CNP и LR обозначают кожицу корня коронки, коронку без кожуры и боковые корни соответственно. SP и SNP обозначают стебли кожуры и стебли без кожуры соответственно. Эти графики не включают целые секции ствола и кроны (SWP и CWP). Знак Δ обозначает корень короны, боковые корни обозначаются символом Ο, а символ stem обозначает стебли.

На уровне ткани PCA1 для ГХ-МС отличает CNP, CRP и LR от SNP, тогда как отрицательный LC-MS отличает CNP, CRP и LR от тканей SP (файл репозитория R10-3) (Student t -тест).PCA1 от отрицательного результата LC-MS также отличает CNP от LR (файл репозитория R10-4) (тест Студента t ). Эти результаты показывают, что существуют тонкие различия в профилях метаболитов между тканями, которые можно обнаружить с помощью наших методов.

Смешанная линейная модель показывает, что коронка и боковые корни мало отличаются друг от друга по метаболическому профилю

Хотя данные PCA (рис. 3A – C) дают представление об общей структуре набора данных, они не позволяют определить распределение отдельных метаболитов. Поэтому для данных ГХ-МС, который является единственным методом количественной спектрометрии, который мы использовали, мы построили начальную серию линейных моделей для каждого метаболита с фиксированным термином для структурной локализации (с уровнями «корень корня», «боковой корень», »И« стебель ») и номер растения как случайный эффект. Используя скорректированный порог частоты ложных открытий (FDR) P <= 0,05, термин «структурные местоположения» показал значительную связь с 21 из 28 метаболитов (дополнительная таблица S4). Попарное тестирование с помощью теста Стьюдента t каждого метаболита с P <0.05 Бенджамини-Хохберг - скорректированное значение P показало, что большинство значимых различий было между «стеблем» и двумя типами корней (файл репозитория R10-5), и только 5 из 43 попарных значимых тестов между «короной» корень »и« боковые корни [22] ». Метаболитами, которые значительно различались между типами корней, были флавокаин С, пиностробин, гедикариол, δ-кадинол и борнилциннамат (архивный файл R10-5, обозначенный знаком решетки) [22].

Эти данные о «структурных положениях» дают общую картину метаболитов в различных частях растения.Чтобы развить более точное понимание, мы построили вторую серию смешанных линейных моделей с термином для типа ткани (с уровнями «LR», «CRP», «CNP», «SP» и «SNP») и растения как случайный эффект. Эти модели «тканевого типа» продемонстрировали значимые ассоциации для 24 из 29 метаболитов для термина типа ткани (дополнительная таблица S4). Из 354 парных тестов 104 были значимыми (файл репозитория R10-6). Однако только 6 из этих значимых тестов проводились между LR и тканями корня коронки, и все они были CNP против LR.Помимо сквалена, те же 5 метаболитов были обнаружены значимыми в модели структурного местоположения (файл репозитория R10-6, обозначенный знаком решетки). Ни один из значительных метаболитов, различающихся между CNP и LR, не является кавалактонами, что указывает на то, что LR и корончатые корни имеют очень мало различий в присутствии кавалактонов, но что они оба отличаются от тканей стебля с точки зрения профилей кавалактона.

Парный анализ показывает, что содержание каваина, десметоксиянгонина и дигидрометистицина в корнях выше, чем в стеблях

Из всех кавалактонов, для которых мы построили статистические модели, каваин, десметоксиянгонин и дигидрометистицин особенно интересны из-за их хорошо известной неврологической активности среди других кавалактонов в растении [10, 11, 23].В соответствии с традиционным использованием корней в народной медицине, концентрации всех 3 этих метаболитов были значительно ниже в обоих типах стволовых тканей, чем во всех образцах корней, на основании скорректированных FDR-тестов Student t для всех 29 протестированных метаболитов (рис. . 3D – F) и количественный анализ ГХ-МС (таблица 1) [17]. Все 3 метаболита, по-видимому, имеют более высокую концентрацию в LR, чем в корневых корнях; однако наш статистический анализ не смог существенно дифференцировать эти метаболиты в изолированных тканях.

Боковые корни имеют морфологические характеристики, подходящие для максимального содержания синтеза кавалактона

Хотя корни кавы служат основным источником кавалактонов, изучение их морфологических особенностей остается неизведанной областью. Поэтому мы исследовали трехмерные топологические структуры боковых и корончатых корней с помощью рентгеновской компьютерной микротомографии (μCT) (рис. 4, дополнительный рисунок S1 и репозиторий R7). Трехмерные изображения обеспечивают визуализацию внутренней структуры ткани и понимание морфологии и функциональных взаимосвязей.Из-за ограниченного размера выборки (n = 2 отдельных растения) к этим изображениям нельзя было применить строгий статистический анализ. Однако, чтобы изучить различия в свойствах тканей, которые могут быть коррелированы с различиями в синтезе метаболитов, мы вычислили различные геометрические дескрипторы на имеющихся наборах данных изображений [24, 25]. Фактор формы пустот и диаметр Ферета _макс. показали разницу в раз> 4,0 и> 1,6 соответственно, что позволяет предположить, что LR и корончатые корни четко различимы по морфологическим характеристикам, которые влияют на их газообменные свойства.Мы обнаружили, что корни коронки имеют больший диаметр по Ферету _макс , а заполненные воздухом пространства кажутся более неструктурированными, широкими и слитыми по сравнению с LR, где заполненные воздухом пространства более структурированы и расположены в радиальном направлении вдоль костного мозга. лучи (дополнительная таблица S5 и файлы видео репозитория S1 и S2) [26, 27].

Рисунок 4:

Рентгеновские снимки μCT коронки и боковых корней P. methysticum . (A – H) и (I – P) обозначают изображения трехмерных реконструкций поверхности на основе данных µCT коронки и боковых корней соответственно. (A) и (B) — сегментированные заполненные воздухом пространства в паренхиме и пробке (кожуре). (C) представляет собой наложение пробковых и заполненных воздухом областей в паренхиме корней коронки. (D) Трехмерное изображение всего участка корня коронки. (E), и (F), представляют изображения корней коронки в поперечном разрезе в трехмерной визуализации и шкале серого соответственно. (G), и (H), представляют изображения корней коронки в продольном разрезе в серой шкале и трехмерной визуализации соответственно. (I) и (J) представляют собой сегментированные ткани боковых корней, содержащие заполненные воздухом пространства в паренхиме и пробке (кожуре), соответственно. (K) показывает наложение сегментированных областей боковых корней, включая пробковые и заполненные воздухом области в паренхиме. (L) Трехмерное рендеринг-изображение всего участка боковых корней. (M) и (N) представляют собой поперечный вид боковых корней в 3D-рендеринге и шкале серого. (O) и (P) представляют изображения продольных видов боковых корней в серой шкале и 3D-рендеринг.Секции a, b, c и d представляют собой пробку, кору, паренхиму и заполненные воздухом пространства соответственно.

Рисунок 4:

Рентгеновские изображения μCT коронки и боковых корней P. methysticum . (A – H) и (I – P) обозначают изображения трехмерных реконструкций поверхности на основе данных µCT коронки и боковых корней соответственно. (A) и (B) — сегментированные заполненные воздухом пространства в паренхиме и пробке (кожуре). (C) представляет собой наложение пробковых и заполненных воздухом областей в паренхиме корней коронки. (D) Трехмерное изображение всего участка корня коронки. (E), и (F), представляют изображения корней коронки в поперечном разрезе в трехмерной визуализации и шкале серого соответственно. (G), и (H), представляют изображения корней коронки в продольном разрезе в серой шкале и трехмерной визуализации соответственно. (I) и (J) представляют собой сегментированные ткани боковых корней, содержащие заполненные воздухом пространства в паренхиме и пробке (кожуре), соответственно. (K) показывает наложение сегментированных областей боковых корней, включая пробковые и заполненные воздухом области в паренхиме. (L) Трехмерное рендеринг-изображение всего участка боковых корней. (M) и (N) представляют собой поперечный вид боковых корней в 3D-рендеринге и шкале серого. (O) и (P) представляют изображения продольных видов боковых корней в серой шкале и 3D-рендеринг. Секции a, b, c и d представляют собой пробку, кору, паренхиму и заполненные воздухом пространства соответственно.

Объем межклеточных пространств, сферичность пустот и процентная пористость были сравнительно выше в LR, чем в коронных корнях, что указывает на более сложную и сильно связанную сеть воздушного пространства (дополнительная таблица S5) [28–30]. Анизотропия, которая влияет на морфогенез органов растений [31], имела значения, которые были выше для корневых корней по сравнению с LR, что указывает на более высокий морфогенез в кроновых корнях [32]. Было обнаружено, что значения коэффициента формы пустот корней кроны выше, чем у LR (Таблица S5), и могут коррелировать с соответствующими высокими значениями анизотропии [33]. Основываясь на результатах морфометрических параметров и геометрических дескрипторов, найденных в этом исследовании, мы предполагаем, что LR демонстрируют характеристики газообмена и метаболизма, которые можно считать лучше, чем у корневых корней. Эти результаты согласуются с результатами количественного анализа с помощью ГХ-МС, где было обнаружено, что LR имеет самое высокое содержание кавалактона. В то время как будущая работа с большим размером выборки потребуется для определения статистической значимости этих ассоциаций, эти данные действительно предполагают, что LR имеют тканевые структуры для лучшего газообмена и синтеза метаболитов по сравнению с корневыми корнями.

Массовое исследование тканей показывает, что каваин имеет более высокое содержание

Хотя спектрометрические анализы, использованные в этом исследовании, являются информативными, они требовали разрушения тканевых структур для извлечения метаболитов. Чтобы визуализировать распределение кавалактонов in planta в стеблях, LR и корневых корнях перед любой обработкой или экстракцией, мы использовали инфракрасный матричный анализ с лазерной десорбцией и ионизацией электрораспылением (IR-MALDESI).

Из 6 проанализированных лактонов кавы каваин ( m / z : 231.1016), дигидрокаваин ( m / z : 233,1172) и янгонин ( m / z : 259.0965) имели относительно более высокое содержание по сравнению с дигидрометистицином. ( m / z : 277.1071), метистицин ( m / z : 275.0914) и десметоксиянгонин ( m / z : 229.0859) (рис. 5). В LR каваин присутствует в большом количестве в паренхиме, тогда как в корнях корня он обнаруживается во всех трех тканях (паренхиме, пробке и коре).Было обнаружено, что дигидрометистицин, метистицин, дигидрокаваин и янгонин наиболее распространены в паренхиме, с меньшим содержанием в пробковой и корковой областях обоих типов корней (дополнительные рисунки S2 – S4). В тканях стебля обнаружено меньшее содержание всех протестированных кавалактонов, кроме десметоксиянгонина, по сравнению с боковыми и корончатыми корнями. Было обнаружено, что содержание десметоксиангонина одинаково во всех образцах корня и стебля.

Рисунок 5: Тепловые карты содержания ионов

IR-MALDESI для различных компонентов в разных частях P.methysticum . ( A ) Распределение каваина (K), 7,8-дигидро-5,6-дегидрокаваина (5,6-DDK): m / z 231,1016. ( B ) Оптические изображения различных деталей. ( C ) Распределение десметоксиянгонина (DMY): m / z 229.0859. ( D ) Распределение дигидрометистицина (DHM) m / z 277. 107. Изображения в a – c, d – f и g – i указывают изображения образцов боковых корней, корневых корней и стебля соответственно.

Рисунок 5: Тепловые карты содержания ионов

IR-MALDESI для различных компонентов в разных частях P.methysticum . ( A ) Распределение каваина (K), 7,8-дигидро-5,6-дегидрокаваина (5,6-DDK): m / z 231,1016. ( B ) Оптические изображения различных деталей. ( C ) Распределение десметоксиянгонина (DMY): m / z 229.0859. ( D ) Распределение дигидрометистицина (DHM) m / z 277. 107. Изображения в a – c, d – f и g – i указывают изображения образцов боковых корней, корневых корней и стебля соответственно.

Идентификации IR-MALDESI основаны на высоком разрешении и точной массе.Однако, поскольку ткани растений имеют сложный профиль вторичных метаболитов, мы также подтвердили эти определения путем измерения спектральной точности в дополнение к измерению массы. Тепловые карты подсчета изотопов, созданные с помощью подсчета углерода на основе спектральной точности для ¹² C, ¹³ C-1, показали, что сигналы на ткани для всех идентифицированных ионов были очень похожи на те, которые были идентифицированы на тепловых картах изобилия, что подтверждает надежность наших идентификаций по методам (дополнительный рис. S5) [34–36].

Подтверждение идентификации целевых кавалактонов в тканях растений проводилось с помощью тандемной масс-спектроскопии (МС / МС) фрагментации стандартов, сравнения сгенерированных фрагментных ионов и наложения спектров из стандартов и тканей растения (рис. 6А и Репозиторий рис. R8 и R9). Соотношение фрагментов стандартного каваина соответствовало соотношению фрагментов, полученных из тканей корня и стебля. Это демонстрирует, что идентификация каваина в образцах корня кроны и стебля достоверна и подтверждается анализом МС / МС.

Рисунок 6:

МС / МС-хроматограммы и картина фрагментации каваина, полученные при параллельном мониторинге реакции (PRM) MALDESI. (A) представляет собой наложенные хроматограммы стандартного соединения, (B) представляет собой образец фрагментации каваина, а (C) и (D) представляют собой наложенные хроматограммы каваина на ткани корня коронки и стебля, соответственно. По оси ординат отложено содержание предшественника (вверху) и фрагментов МС / МС (внизу) каваина ( м / z : 231.1016). Ось абсцисс показывает время (мин).

Рис. 6:

МС / МС-хроматограммы и картина фрагментации каваина, полученные при параллельном мониторинге реакции (PRM) MALDESI. (A) представляет собой наложенные хроматограммы стандартного соединения, (B) представляет собой образец фрагментации каваина, а (C) и (D) представляют собой наложенные хроматограммы каваина на ткани корня коронки и стебля, соответственно. По оси ординат отложено содержание предшественника (вверху) и фрагментов МС / МС (внизу) каваина ( м / z : 231.1016). Ось абсцисс показывает время (мин).

Обсуждение

Кава широко представлена ​​на мировом рынке трав для успокаивающего и рекреационного использования, предлагая нерегулируемый ассортимент продукции, состоящий из напитков, лекарственных трав и пищевых добавок. Растет потребность в подтверждении с помощью научных исследований традиционной практики использования только очищенных корней кавы для приготовления напитков. Поскольку каждый кавалактон обладает комплексным набором неврологических эффектов (психотических, анксиолитических и стабилизирующих настроение), также важно охарактеризовать тканеспецифическое присутствие и содержание в корнях кавы [37–39].Настоящее исследование представляет собой важный начальный шаг к этой цели.

В этом исследовании количественный тканеспецифический анализ с помощью ГХ-МС показал, что среди отделенных тканей СРБ имел самую высокую концентрацию каваина и десметоксиянгонина. Сообщается, что десметоксиянгонин и каваин всасываются быстрее, чем другие кавалактоны, и вызывают внезапный «кайф» эйфории [2, 40]. Практика использования только очищенных корней может избежать нежелательных эффектов внезапного эйфорического подъема у потребителей напитков кавы, приготовленных из кожуры.Результаты этого исследования предоставляют научные доказательства, которые согласуются с традиционной практикой использования только очищенных корней.

Сообщается, что концентрация нерегулируемых напитков в барах кава ( Nakamals ) в 150 раз превышает терапевтическую дозу, что часто приводит к острой интоксикации, когнитивным нарушениям и диссоциативным (галлюциногенным) эффектам [41, 42]. Количественный анализ в этом исследовании показывает, что боковые корни имеют самую высокую концентрацию всех трех целевых кавалактонов, каваина, дигидрометистицина и десметоксиянгонина.

Наше исследование раскрывает важную взаимосвязь между тканеспецифическим синтезом вторичных метаболитов в корнях кавы, их традиционным использованием и вытекающими из этого фармакологическими эффектами. Мы использовали современные неинвазивные методы визуализации вместе с анализом необработанных тканей растений, чтобы преодолеть недостатки ранее опубликованных исследований путем картирования in situ профилей метаболитов кавы. Путем изучения метаболитов, биосинтезируемых в определенных тканях растения кава, исследование обеспечивает будущие возможности для сбора важных с медицинской точки зрения кавалактонов, имеющих отношение к открытию противоэпилептических и седативных снотворных препаратов из природных источников. Идентификация кавы на основе морфологии и масс-спектрометрии предоставляет данные, которые могут помочь в различении примесей и нежелательного растительного материала в сырье, используемом для приготовления продуктов кавы. Результаты этого исследования важны для производителей продуктов кавы, органов регулирования пищевых продуктов и потребителей для безопасного выбора частей растения кавы для составления и потребления продукта. Значение этого исследования заключается в рассмотрении основных, но важных проблем, которые лежат в нынешнем нерегулируемом и нестандартном употреблении кавы, которая стала всемирно распространенной рекреационной альтернативой нейроактивным наркотикам, способствующей успокоению.

Методы

Анализ ЖХ-МС

корня благородного сорта кавы под названием «Лоа Лека» были собраны в последнюю неделю мая 2017 года в Тавеуни, Фиджи. Образцы были зрелыми> 3 лет и были предоставлены в качестве подарка от компании Haridaya Enterprises Ltd., Фиджи. Было собрано около 6 кг образцов корней, по 3 образца для выбранных частей растения. Во время сбора урожая пень оставался прикрепленным к корню.Образцы корней и стеблей P. methysticum были проанализированы с помощью системы ГХ Agilent 7890A, соединенной с масс-селективным детектором (МСД) с электронной ионизацией (EI) Agilent 5975C и системой UPLC-QTOF MS (Acquity UPLC-SYNAPT MS, Waters Corp., Милфорд, Массачусетс). Для ЖХ-МС образцы анализировали после экстракции порошкообразного растительного материала в этаноле (0,5 мг / мл) с помощью ультразвуковой обработки (Elma, Elmasonic P30H) при комнатной температуре в течение 30 минут. Для нецелевого профилирования приготовленных экстрактов с помощью анализа ЖХ-МС использовали систему МС UPLC-QTOF.Он был оснащен аналитической колонкой ACQUITY BEH UPLC C ₁₈ (внутренний диаметр 1,7 мкм, размеры 2,1 × 100 мм, Waters). Анализы проводились как с положительной, так и с отрицательной ионизацией электрораспылением (ESI), чтобы получить полный охват при профилировании. В режиме положительного ESI подвижная фаза содержала 0,1% муравьиной кислоты в воде (растворитель A) и 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле (растворитель B). В режиме отрицательного ESI подвижная фаза составляла 1 мМ фторид аммония в воде (растворитель A) и ацетонитриле (растворитель B).Градиент, используемый в положительном режиме ESI, составлял 0–1 мин (1–15% B), 1–3 мин (15–50% B), 3–8 мин (50–85% B), 8–10 мин (85% B). –100% B), 10–11 мин (100% B), 11–11,5 мин (100–1% B), 11,5–13 мин (1% B). Для отрицательного режима ESI использованный градиент составлял 0–1 мин (1–20% B), 1–3 мин (20–60% B), 3–6 мин (60–85% B), 6–8 мин (85% B). –100% B), 8–11 мин (100% B), 11–11,5 мин (100–1% B), 11,5–13 мин (1% B). Лейцин-энкефалин использовали в качестве стандарта замковой массы как в положительном, так и в отрицательном режимах ([M + H] ⁺ 556,2771 Да и [M-H] ^— 554. 2615 Да). Для нормализации использовался метод внутреннего стандарта. К каждому образцу перед анализом добавляли 2 мкг пара-хлорфенилаланина в качестве внутреннего стандарта. Скорость потока была установлена ​​равной 0,4 мл / мин с капиллярным напряжением 3,2 и 3,5 в режимах положительного и отрицательного ESI, соответственно. Температуру десольватации устанавливали на 350 ° C, а используемый диапазон масс составлял 50–1000 Да. Файлы исходных данных, полученные в результате анализа ЖХ-МС, были обработаны с использованием программного обеспечения Progenesis QI (Waters Corp., Милфорд, Массачусетс).Результирующий набор данных был организован в матрицу, включающую информацию об образце, метки для всех обнаруженных пиков (пары масс времени удерживания) и определение интенсивности для каждого обнаруженного пика. Точная информация о массе использовалась для идентификации соединений. Поиск метаболитов METLIN и базы данных PubChem использовались для проверки идентичности всех метаболитов путем сравнения их конкретных молекулярных ионов и масс.

Анализ ГХ-МС

Для ГХ-МС порошкообразный растительный материал экстрагировали ацетоном (0.25 г / мл) в тех же условиях, что и образцы ЖХ-МС. Каждый из этих образцов был дополнительно разбавлен 2 мл ацетона. Все образцы центрифугировали при 12000 об / мин в течение 10 мин (Centrifuge 5427R, Eppendorf, Enfield, CT, USA). Экстрагированные супернатанты хранили при 4 ° C до анализа. К каждому образцу добавляли 20 мкл метилового эфира докозановой кислоты в качестве внутреннего стандарта (200 мкг / мл). Образцы сушили в потоке газообразного азота, дериватизировали триметилсилилом (TMS) (Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) и инкубировали при 70 ° C в течение 60 минут перед анализом.

Три стандарта каваин, дигидрометистицин и десметоксиянгонин были приобретены в Avachem Scientific, Сан-Антонио, Техас, США. Все растворители, использованные для анализа, были масс-спектрометрической чистоты. Количественный и качественный анализ проводился на 3 образцах каждой выбранной экспериментальной группы.

Капиллярная колонка DB-5MS (длина 30 м, внутренний диаметр 250 мкм, толщина пленки 0,25 мкм) использовалась с гелием в качестве газа-носителя с расходом 1 мл мин. ^-1 .Режим без разделения был использован с программой печи, установленной на начальную температуру 50 ° C в течение 1 минуты, а затем увеличивающуюся до 280 ° C со скоростью 50 ° C в течение 5 минут. Температура интерфейса переноса была установлена ​​на 280 ° C, объем инжекции 1 мкл, энергия электронов -70 В и температура источника МС 230 ° C. Режим сканирования использовался для сбора характеристических ионов и регистрации их времен удерживания (диапазон масс m / z 45–600). Необработанные данные обрабатывались путем сглаживания базовой линии и выбора пика. Сглаживание базовой линии, выбор пиков, автоматическая и ручная идентификация пиков и интеграция пиков выполнялись с использованием программного обеспечения LECO ChromaTOF (версия 4.51.6.0). В рамках процесса разработки метода для количественной оценки данных был разработан метод обработки данных для интегрирования определенных масс ионов при определенном времени удерживания. Идентификация пиков проводилась вручную и с помощью автоматического вывода. Все опознания опрашивались вручную и при необходимости корректировались. Для аннотации метаболитов использовался поиск в библиотеках Национального института стандартов и технологий и базы данных PubChem. Для количественного анализа построены калибровочные кривые стандартных соединений каваина, десметоксиангонина и дигидрометистицина.

Для количественного анализа с использованием ГХ-МС необработанные данные были обработаны с помощью Agilent Chemstation, экспортированы в формат .aia и обработаны с использованием программного обеспечения LECO ChromaTOF (4.51.6.0, Leco Corporation, Сент-Джозеф, Мичиган). Были построены калибровочные кривые стандартов для количественного анализа каваина, дигидрометистицина и десметоксиянгонина во всех отобранных образцах. Нормализация с помощью внутреннего стандарта была проведена до использования данных для статистического анализа.

Методы, применяемые для разработки моделей статистической визуализации

Анализ главных компонентов

Данные метаболитов были преобразованы с использованием функции prcomp R-stats для многомерного масштабирования (PCA) с использованием евклидова расстояния. Вкратце, эта функция создает многомерную матрицу, которая затем делится по оси, где дисперсия наибольшая. Затем функция возвращает матрицу оси 1D в порядке от наибольшей дисперсии к наименьшей. Для большинства представленных анализов использовались только 3 верхних оси.

Линейная модель со смешанными эффектами

Из библиотеки nlme в R (версия 3.1–144) была использована линейная модель со смешанными эффектами для исследования фиксированных эффектов категорий данных метаданных и случайных эффектов количества растений на данные метаболитов (метаболит ∼ метаданные + номер растения) и по результатам PCA (PCA ∼ метаданные + номер завода).Значимость определялась с помощью функции ANOVA в R.

Односторонний ANOVA

Используя базовую функцию ANOVA R, был использован односторонний ANOVA для оценки значимости данных метаболитов и данных PCA метаболитов, сгруппированных по категориям метаданных (тип ткани, часть растения, корень против стебля, целое сечение или часть секции, только кожура против не только кожура, кожура присутствует против кожуры без кожуры и номер растения). P -значения корректировали с использованием метода Бенджамини-Хохберга. P <0,05 было произвольно установлено в качестве порога значимости.

t-тест студента

Тест Стьюдента t использовался для проверки попарных сравнений с использованием функции базового t.test R. P -значения корректировали с использованием метода Бенджамини-Хохберга. P <0,05 было произвольно установлено в качестве порога значимости.

Криосрезы образцов

Образцы для криосрезов были приготовлены по модифицированной методике, опубликованной в одном из наших предыдущих исследований [43].Образцы корней и стеблей кавы были обернуты нецеллюлозной бумагой, смоченной сверхчистой водой, на 12 часов при комнатной температуре. Затем образцы хранили в течение ночи под вакуумом при 635 мм рт.ст. перед криосрезами для облегчения размягчения тканей за счет проникновения влаги. Образцы были разрезаны на секции диаметром ∼1.5–2 см для установки на блок криостата. Укладка вырезанных срезов на блоки криостата была выполнена с использованием матрицы Surgipath Cryo-Gel (Leica Microsystems, Вецлар, Германия).Криогель — водорастворимая вязкая жидкость, которая при замораживании образует полимерный гель [44]. Криосрезы тканей выполняли с помощью криостата Leica CM1950 (Buffalo Grove, IL, USA) при -20 ° C. Срезы толщиной 25 мкм были приготовлены и тщательно разморожены, помещены на предварительно очищенные стеклянные предметные стекла.

Анализ IR-MALDESI

Направляющие с секциями были установлены на предметном столике Пельтье с водяным охлаждением и управлением перемещением по оси XY, помещенном в специальный корпус MALDESI.Кожух продували азотом до достижения относительной влажности <10%, после чего ступень Пельтье охлаждалась до -10 ° C. После некоторого времени для уравновешивания температуры корпус открыли, и образец подвергли воздействию относительной влажности окружающей среды. Это привело к образованию тонкого слоя льда на образце. Корпус снова закрыли, а относительная влажность поддерживалась постоянной на уровне ~ 8–12% на протяжении всего анализа. Перестраиваемый лазер среднего ИК диапазона (IR Opolette 2371, OPOTEK, Carlsbad, CA, USA) настроен на 2.94 мкм было использовано для стрельбы по ткани, что привело к десорбции нейтральных веществ из ткани. Это происходило за счет резонансного возбуждения режима растяжения O-H воды, эндогенно присутствующей в тканях образца и созданном слое льда. Десорбированные нейтралы встречались с ортогональным факелом электрораспыления, который ионизировал их аналогично ESI. Ионы от каждого события десорбции синхронно анализировались в Q Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific, Бремен, Германия) с отключенной автоматической регулировкой усиления (AGC), чтобы соответствовать импульсной природе IR-MALDESI.Вместо AGC использовалось фиксированное время инжекции (IT) для накопления ионов, возникающих в результате лазерных импульсов с частотой 20 Гц. В диапазоне m / z от 100 до 400 достигнутая разрешающая способность составила 140 000 (FWHM, м / z = 200). Точность измерения массы составляла части на миллион (ppm), и для калибровки использовались калибранты замкнутой массы (источник 47 при переключении полярности).

Абляция образца ткани проводилась с профилем луча 150 мкм, а изображения были получены с шагом 100 мкм, чтобы гарантировать полную абляцию ткани из-за передискретизации.Визуализация проводилась с шагом 100 мкм, и было установлено, что она подходит для визуализации структурных особенностей образцов корня и стебля. Режим положительных ионов использовался для анализа с диапазоном низких значений массы и заряда 100–400 m / z . Первоначально ионы были идентифицированы по моноизотопу, [M + H ⁺ ] ⁺ m / z каждой молекулы. После этого этапа была определена спектральная точность, чтобы гарантировать, что идентифицированное значение m / z имело соответствующее соотношение изотопов ¹³ C ₁ для соответствующего встречающегося в природе соединения. Тепловая карта подсчета изотопов сравнивает пик A + 1 с пиком A в виде определенного процента. Этот процент делится на процентное содержание углерода, которое естественно составляет ¹³ C (от 0,96 до 1,15%). В этом исследовании использовался процент ∼1,12%, и каждый пиксель был нанесен на график, на сколько расчетных атомов углерода он находился от значения m / z исходного соединения . Затем были построены изображения, в которых каждый воксель коррелировал с соответствующим событием десорбции и инструментальным анализом. Подсчет углерода на основе спектральной точности для ¹² C, ¹³ C ₁ был проведен для выбранных кавалактонов для характеристики образцов [34, 35].Функция «Тепловая карта подсчета изотопов» в MSiReader использовалась для построения расчетных значений углерода для каждого из целевых лактонов кавы [45].

Анализ МС / МС в режиме параллельного мониторинга реакции (PRM) с теми же настройками прибора был использован для определения присутствия каваина, десметоксиянгонина и дигидрометистицина. Режим PRM использовался для фрагментации иона-предшественника и других сгенерированных фрагментов. Каждый сгенерированный фрагмент идентифицировали с помощью программного обеспечения для прогнозирования (metfrag) и сравнивали с опубликованными в литературе сообщениями [46, 47].Фрагменты целевых соединений из тканей сравнивали со стандартными соединениями и литературными сообщениями [48]. В режиме PRM в Thermo MS на базе Orbitrap каждое n-е сканирование предназначено для полного сканирования MS по всему интересующему диапазону м / z или одному или другому из выбранных м / z . В данном конкретном случае первое сканирование было полным сканированием MS от 120 до 480 м / z , следующим было сканирование MS / MS 231.1016 с окном изоляции 1.5 m / z фрагментировано с нормализованной энергией столкновения (NCE) = 30, третьим было сканирование MS / MS 277,1071 с NCE = 20, а четвертым было сканирование MS / MS 229,0859 с NCE = 35; затем цикл повторяется. Каждое значение NCE было оптимизировано в неопубликованных экспериментах (рис. 6).

MSiReader (v1.01k), свободно доступная программа, разработанная собственными силами специально для масс-спектрометрической визуализации, использовалась для проверки идентичности представляющих интерес ионов, визуализируемых при заданном m / z [49].

Рентгеновский микротомографический анализ

Анализ μCT проводился с использованием мобильной компактной настольной системы, разработанной в Центре разработки рентгеновских технологий Фраунгофера EZRT (энергия луча 50 кВ). Для анализа были использованы по два образца, от бокового и корневого корня, которые лучше всего отображали морфологические особенности и не имели каких-либо морфологических повреждений. Для анализа данных использовались два набора данных изображения каждого, короны и LR. Эталонный капилляр известного диаметра использовался для измерения разрешающей способности изображений. Образцы были установлены вертикально на вращающемся столике и подтверждена их фиксация до воздействия света синхротронного излучения. Энергия пучка 50 кВ использовалась с изотропным номинальным разрешением 38,1 и 35,3 мкм / пиксель для корневых корней и 17,3 и 17,2 мкм / пиксель для LR, соответственно. Время экспозиции для каждого образца при сканировании составляло 400 мс. Расстояние между сканером и образцами для каждого корня коронки составляло 183,4 и 169,9 мм, а для LR — 83,3 и 82.8 мм соответственно. Всего было записано 3200 проекций с шагом вращения на 360 °.

Обработка изображений синхротронного излучения — данные µCT

Постобработка полученных проекций микроконтактной компьютерной томографии проводилась с использованием программы pyXIT [50]. На основе данных μCT коронки и боковых корней были выполнены трехмерные реконструкции поверхности с использованием программного обеспечения Avizo Fire 9.3.0 (FEI, Хиллсборо, Орегон, США), а затем снова проанализированы с помощью Avizo Fire. Мы выполнили 3D-рендеринг и сегментацию различных частей корней, применив протокол проекта, разработанный для визуализации и сегментации.Шаги протокола включали создание орто-срезов, меток для сегментации различных частей корня, повторную выборку, создание поверхности и просмотр. Изображения были помечены и сегментированы на области, включая внешнюю поверхность, весь корень, межклеточные воздушные пространства и эпидермис. Повторная выборка помеченных полей проводилась до создания поверхности, чтобы уменьшить размеры сетки и облегчить создание поверхности. Функция просмотра поверхности использовалась для 3D-рендеринга и визуализации изображений микро-КТ образцов корня.Пористость проанализированных образцов рассчитывалась с применением модуля ASBMR. Были рассчитаны геометрические дескрипторы тканевых структур, которые коррелируют с их функциями газообмена, чтобы идентифицировать корреляцию между структурой и профилями вторичных метаболитов боковых и корончатых корней. Диаметр Feret, трехмерные объемы, анизотропия и т. Д. Были рассчитаны с применением модуля арифметического анализа и анализа меток. Подробная информация обо всех параметрах, используемых при анализе изображений, представлена ​​на Рис.R7 в [22].

Наличие подтверждающих данных и материалов

Для статистического анализа использовались версии R studio 1.0.143 и R 3.5.1 (Feather Spray) для всех вычислений и обработки данных. Данные о метаболизме депонированы в базу данных EMBL-EBI MetaboLights [51] с идентификатором MTBLS1485. Коды для всех тестов можно найти в [52]. Дополнительные файлы данных репозитория находятся в [22]. Снимки нашего кода и другие вспомогательные данные можно найти в репозитории GigaScience , GigaDB [53].

Дополнительные файлы

Дополнительная таблица S1 . Метаболиты, идентифицированные в корнях P. methysticum с помощью анализа ГХ-МС

Дополнительная таблица S2 . Метаболиты, общие для различных частей P. methysticum , идентифицированы с помощью анализа ЖХ-МС

Дополнительная таблица S3 . Вторичные метаболиты в различных тканях P. methysticum , идентифицированные с помощью анализа ЖХ / МС

Дополнительная таблица S4 . P — значения смешанной линейной модели с данными ГХ-МС

Дополнительная таблица S5 . Трехмерные морфологические и геометрические дескрипторы корней P. methysticum

Дополнительный рисунок S1 . Графические изображения частей растения P. methysticum и их изображения с помощью микроконтактной томографии и разрезы

Дополнительный рисунок S2 . Тепловые карты содержания ионов IR-MALDESI для различных компонентов в разных частях P.methysticum

Дополнительная фигура S3 . Тепловая карта изотопного подсчета кавалактонов в различных тканях P. methysticum

Сокращения

AGC: автоматическая регулировка усиления; ANOVA: дисперсионный анализ; CNP: корончатые корни без кожуры; CRP: пилинг корня кроны; CWP: корончатые корни с кожурой; EI: электронная ионизация; EMBL-EBI: Европейская лаборатория молекулярной биологии Европейский институт биоинформатики; ESI: ионизация электрораспылением; ФАО: Продовольственная и сельскохозяйственная организация; FDR: коэффициент ложного обнаружения; FWHM: полная ширина на полувысоте; ГХ-МС: газовая хроматография – масс-спектрометрия; IR-MALDESI: инфракрасная матричная лазерная десорбционная ионизация электрораспылением; IT: время впрыска; ЖХ-МС: жидкостная хроматография – масс-спектрометрия; LR: боковые корни; МСД: масс-селективный детектор; МС / МС: тандемная масс-спектроскопия; NCE: нормализованная энергия столкновения; PCA: анализ главных компонентов; PRM: мониторинг параллельных реакций; pyXIT: средство визуализации рентгеновских изображений Python; SNP: стебли без кожуры; SP: кожура стебля; SWP: стебли с кожурой; ТМС: триметилсилил; UPLC-QTOF MS: жидкостная хроматография сверхвысокого качества — квадрупольная времяпролетная масс-спектрометрия; ВОЗ: Всемирная организация здравоохранения; μCT: рентгеновская микрокомпьютерная томография.

Финансирование

Д.У. и D.H. выражают признательность за финансовую поддержку Министерству экономики, регионального развития и энергетики Баварии. Это исследование получило финансовую помощь от Национальных институтов здравоохранения по грантам R01GM087964 и T32 Biotechnology Traineeship T32GM008776 (M.C.B).

Вклад авторов

Ю.С.Дж. и L.L.W. разработал и инициировал исследование. Y.S.J., D.W., D.H., M.C.B и M.E. провели исследование. A.F., D.C.M., D.H. и L.L.W. предоставили помощь и экспертные заключения в разработке, анализе и проведении экспериментов. Y.S.J., A.M.Y., M.C.B. и A.F. написали рукопись и проанализировали данные. ЭМИ. и A.F. написали сценарии Python и R для статистического анализа данных и создания графиков визуализации.

БЛАГОДАРНОСТИ

Центр передового опыта в послеуборочных технологиях ценит поддержку г-наАбхишеку Сапре из Haridaya Enterprises Ltd., Фиджи, за передачу в натуральном виде образцов кавы и организацию логистики для сбора образцов растений.

Список литературы

Lebot

V

Обзор производства кавы на островах Тихого океана: что мы знаем и чего не знаем

J South Pacific Agric

1997

4

55

62

FSANZ

Кава Оценка риска для здоровья человека

Веллингтон, Новая Зеландия

Стандарты пищевых продуктов Австралия Новая Зеландия

2004

1

26

Сингх

YN

Кава: обзор

Дж. Этнофармакол

1992

37

13

45

Голдберг

AB

Фитотерапия

Остин, Техас

Американский ботанический совет

2000

BPC

Kavae Rhizoma

Британский фармацевтический кодекс

Фармацевтическое общество Великобритании

1907

566

Блюменталь

M

Busse

WR

Полные монографии Немецкой комиссии E: терапевтическое руководство по лекарственным травам

Blumenthal

M.

Бостон, Массачусетс

Американский ботанический совет

1998

xxii

685

Ян

JX

Новый димер кавалактона из Piper methysticum

Chem Nat Compd

2019

55

606

9

юаней

Y

Yang

JX

Nie

LH

Три новых димера кавалактона из Piper methysticum (kava)

J Asian Nat Prod Res

2018

20

837

43

Nerurkar

PV

Dragull

K

Tang

CS

Токсичность in vitro алкалоида кавы, пиперметистина, на клетки HepG2 по сравнению с кавалактонами

Toxicol Sci

2004

79

106

11

ВОЗ

Оценка риска гепатотоксичности продуктов кавы

Женева

Всемирная организация здравоохранения

2007

6

25

CAC

Документ для обсуждения по разработке стандарта для продуктов Kava

Маданг, Папуа-Новая Гвинея

Совместная программа ФАО / ВОЗ по стандартам на пищевые продукты

2012

Lasme

P

Davrieux

F

Montet

D

Количественная оценка кавалактонов и определение хемотипов кавы ( Piper methysticum ) с использованием спектроскопии отражения в ближней инфракрасной области для контроля качества в Вануату

Дж. Сельское хозяйство Food Chem

2008

56

4976

81

Lebot

V

Levesque

J

Генетический контроль хемотипов кавалактона у Piper methysticum сортов

Фитохимия

1996

43

397

403

Lebot

V

Johnston

E

Zheng

QY

Морфологическая, фитохимическая и генетическая изменчивость гавайских сортов ‘авы (Kava, Piper methysticum , Piperaceae)

Экон Бот

1999

53

407

18

Siméoni

P

Lebot

V

Идентификация факторов, определяющих содержание кавалактона и хемотип у кава ( Piper methysticum Forst. F.)

Биохимическая система Экол

2002

30

413

24

Тешке

R

Lebot

V

Предложение по коду стандартизации качества кавы

Food Chem Toxicol

2011

49

2503

16

Rowe

A

Zhang

LY

Ramzan

I

Токсикокинетика кавы

Adv Pharmacol Sci

2011

2011

326724

Pluskal

T

Torrens-Spence

MP

Fallon

TR

Биосинтетическое происхождение психоактивных кавалактонов в каве

Нат Растения

2019

5

867

78

Ho

QT

Verboven

P

Verlinden

BE

Трехмерная многомасштабная модель газообмена во фруктах

Физиология растений

2011

155

1158

68

Уолтон

WH

Статистический диаметр Ферета как мера размера частиц

Природа

1948

162

329

30

Schmitt

M

Halisch

M

Muller

C

Классификация и количественная оценка формы пор в песчаниковых породах-коллекторах с помощью трехмерной рентгеновской микрокомпьютерной томографии

Твердая Земля

2016

7

285

300

Паттерсон

B

Эскобедо-Диас

J.

Деннис-Коллер

D

Количественная оценка встроенных пустот или объектов в трех измерениях с использованием рентгеновской томографии

Microsc Microanal

2012

18

390

8

Jaiswal

Y

Weber

D

Yerke

A

Сорт-заменитель важного в агрономическом и медицинском отношении Serenoa repens (пальма сереноа)

Научный сотрудник

2019

9

4709

Ван Нордвейк

M

Брауэр

G

Количественная оценка пористости корней, заполненных воздухом: сравнение двух методов

Растительная почва

1988

111

255

8

Вонгс-Ари

C

Ноичинда

S

Побочные продукты ферментации гликолиза и вторичные метаболиты, участвующие в адаптации растений в условиях гипоксии до и после сбора урожая

Кусал

КД

Бирадар

MS

Гипоксия и аноксия

Лондон, Великобритания

Intechopen

2018

59

72

Piekarska-Stachowiak

A

Szymanowska-Pulka

J

Potocka

I

Зависимость топологических характеристик клеточного рисунка от анизотропии скорости роста корней редиса

Протоплазма

2019

256

1037

49

Atkinson

JA

Rasmussen

A

Traini

R

Разветвление в корнях: раскрытие формы, функции и регулирования

Физиология растений

2014

166

538

50

Herremans

E

Verboven

P

Verlinden

BE

Автоматический анализ трехмерной микроструктуры ткани паренхимы плодов с помощью рентгеновской микро-КТ объясняет различия в аэрации

БМК Завод Биол

2015

15

264

Барри

JA

Groseclose

MR

Robichaud

G

Оценка обнаружения лекарств и метаболитов в ткани печени с помощью масс-спектрометрии UV-MALDI и IR-MALDESI в сочетании с FT-ICR MS

Int J Масс-спектрометр

2015

377

448

155

Rosen

EP

Bokhart

MT

Nazari

M

Влияние времени накопления ионов C-ловушки на обнаруживаемость аналитов в IR-MALDESI MSI

Анал Химия

2015

87

10483

90

Назари

М

Экелоф

М

Ходжаниязова

S

Прямой скрининг активности ферментов с использованием инфракрасной матричной лазерной десорбции с ионизацией электрораспылением

Масс-спектрометр Rapid Commun

2017

31

1868

74

Baum

SS

Hill

R

Rommelspacher

H

Влияние экстракта кавы и отдельных кавапиронов на уровни нейротрансмиттеров в прилежащем ядре крыс

Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry

1998

22

1105

20

Walden

J

Von Wegerer

J

Winter

U

Влияние каваина и дигидрометистицина на изменения потенциала поля в гиппокампе

Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry

1997

21

697

706

Smith

KK

Dharmaratne

HR

Feltenstein

MW

Анксиолитические эффекты экстракта кавы и кавалактонов в парадигме стресса социальной сепарации цыплят

Психофармакология (Берл)

2001

155

86

90

Левеск

VLaJ

Происхождение и распространение кавы ( Piper methysticum Forst. F., Piperaceae): фитохимический подход

Аллертония

1989

5

223

81

Cairney

S

Maruff

P

Clough

AR

Саккада и когнитивные нарушения, связанные с интоксикацией кавой

Hum Psychopharmacol Clin Exp

2003

18

525

33

Минтай

Нью-Джерси

Устойчивость торговли кавой

Contemp Pac

2009

21

265

97

Jaiswal

Y

Weber

D

Yerke

A

Сорт-заменитель важного в агрономическом и медицинском отношении Serenoa repens (пальма сереноа)

Научный сотрудник

2019

9

4709

Snijders

MLH

Zajec

M

Walter

LAJ

Криогелевый компаунд для заливки биопсии почек

Научный сотрудник

2019

9

15250

Ходжаниязова

S

Назари

M

Garrard

КП

Определение спектральной точности масс-анализатора орбитальной ловушки с помощью масс-спектрометрии изотопного отношения

Анал Химия

2018

90

1897

906

Tarbah

F

Mahler

H

Kardel

B

Кинетика каваина и его метаболитов после перорального применения

J Chromatogr B

2003

789

115

30

Wang

Y

Eans

SO

Stacy

HM

Метод тандемной масс-спектрометрии основных кавалактонов с разбавлением стабильных изотопов и его применения

PLoS One

2018

13

e0197940

Smith

RM

Thakrar

H

Arowolo

TA

Высокоэффективная жидкостная хроматография кава-лактонов из Piper methysticum

J Хроматограф A

1984

283

303

8

Бокхарт

MT

Назари

M

Garrard

KP

MSiReader v1.0: Развитие программного обеспечения масс-спектрометрии с открытым исходным кодом для целевого и нецелевого анализа

Масс-спектрометр J Am Soc

2018

29

8

16

Ульхер

М

Jaiswal

YS

Yerke

AM

Bagley

MC

Подтверждающие данные для «3D-визуализации и метаболомного профилирования показывают более высокое содержание нейроактивного кавалактона в боковых корнях и корнях корончатого корня Piper methysticum (кава).»

База данных GigaScience

2020

Заметки автора

© Автор (ы) 2020. Опубликовано Oxford University Press GigaScience.

Интеграция проектов повышения нефтеотдачи и улавливания и хранения углерода: пример на месторождении Фарнсворт, штат Техас | Западное региональное совещание SPE

Юго-западное партнерство по секвестрации углерода (SWP) — один из семи крупномасштабных демонстрационных проектов, спонсируемых США. С. Министерство энергетики. SWP имеет цель навсегда изолировать более 1 000 000 метрических тонн CO ₂ в рамках активного проекта повышения нефтеотдачи пласта в зрелом заводнении в бассейне Анадарко. CO ₂ для этого проекта антропогенно получен из завода по производству удобрений и этанола. По состоянию на конец 2015 года на месторождении насчитывалось 13 нагнетательных скважин CO ₂ , а в период с октября 2013 года по июль 2015 года было секвестрировано 386 695 метрических тонн CO ₂ . Цели проекта включают оптимизацию баланса EOR / хранения, обеспечение постоянства хранения, и разработка передовых методов хранения углерода с использованием искусственного CO ₂ .

Полевой участок представляет собой отличную лабораторию для тестирования ряда технологий мониторинга в условиях действующего паводка CO ₂ , поскольку разработка месторождения является последовательной и дает множество возможностей для регистрации нулевых исходных данных CO ₂ , данных среднего заводнения и данных из полностью залитые узоры. В рамках проекта были получены данные в нескольких масштабах, включая сейсмические исследования 3D 42 mi ² , базовые и повторные исследования 3D ВСП с центром на трех нагнетательных скважинах, исходные данные межскважинной томографии и повторные исследования между парами нагнетатель / добывающая скважина, пассивная скважина сейсмический массив для мониторинга наведенной сейсмичности, распределенная система температуры и датчики забойного давления и температуры.В рамках проекта было пробурено три скважины на месторождении и было получено более 750 футов керна в интервале коллектора Морроу B и связанных с ним пластах покрышек. Дополнительный мониторинг сосредоточен на почвенном потоке CO ₂ , химии подземных вод, химии пластовых флюидов, а также исследованиях водной и газовой фазовых индикаторов.

Все полученные данные были использованы в детальных геологических моделях, используемых для моделирования потоков жидкости и оценки рисков. Данные трехмерного ВСП и межскважинные данные с повторными съемками позволили провести прямое сравнение коллектора до закачки CO ₂ и через восемь месяцев после закачки с целью визуализации CO ₂ по мере его удаления от нагнетательных скважин.