Как правильно сделать выписку из протокола образец: Выписка из протокола заседания комиссии. Образец и бланк 2021 года

Если говорить о практике, которая имеет широчайшее распространение, то выписки из протоколов заседаний помогают руководству компаний осуществлять деятельность по организации работы своих предприятий, контролировать работу производств, регулировать выполнение распоряжений, приказов (иногда выписки даже являются своего рода их заменителем) и т.д.

При помощи выписок государственные надзорные ведомства, контрагенты, банковские кредитные учреждения своевременно информируются о деятельности фирмы.

Чем отличаются выписка и копия

Некоторые работники организаций ошибочно полагают, что копия и выписка – это одно и то же. Это не совсем так. Между ними есть принципиальное отличие: копия – это абсолютно идентичный оригиналу документ, который делается обычно при помощи копировальной техники. Выписка же – это только некоторая часть оригинала и достаточно часто формируется она от руки (когда из документа берутся только те куски текста, которые требуются в каком-то конкретном случае).

Кто делает выписку

Выписку обычно делает сотрудник предприятия, в чьем ведении находится работа с протоколами, в том числе по их сохранению (это может быть секретарь, юрист или сам руководитель организации).

При этом выписка обязательно должна быть заверена уполномоченным на этом работником компании. Также на выписке должна стоять печать (если компания применяет штампы для визирования бумаг).

Как получить выписку

Чтобы получить требуемую выписку от заинтересованного лица, должен поступить соответствующий запрос или заявление в письменном виде с обозначением причин, по которым ему нужен данный документ и указанием учреждения, для предоставления в которое он понадобился.

Образец выписки из протокола заседания комиссии

При необходимости сделать выписку, посмотрите ее пример – с его помощью вы без труда сделаете то, что вам нужно.

1. В начале документа обязательно напишите наименование организации, также укажите состав комиссии, отметьте повестку дня.
2. Далее выпишите те данные из хода заседания, которые касаются заинтересованного лица и обязательно – решение комиссии.
3. После этого, в конце документа поставьте надпись «Верно» или «Выписка верна», подпишите и датируйте бланк.

Выписка из протокола общего собрания — образец 2020 и 2021

Скачать образец выписки из протокола общего собрания акционеров

Скачать образец выписки из протокола общего собрания ООО

Скачать образец выписки из решения общего собрания

Что такое протокол мероприятия

Протокол — это официальный документ, который ведется в письменном виде в ходе общего собрания людей, объединенных одним делом или проблемой. Общий сбор может быть у жильцов одного дома, акционеров или работников предприятия, а записывать результаты события сейчас требуют даже на родительских собраниях в школах. В резолюции отражают ход событий, перечень затрагиваемых вопросов и обсуждений, очередность выступлений и их основные тезисы, а также принятые решения.

Поскольку выписка из протокола общего собрания, образец которой представлен в статье, — это частичная копия стенограммы мероприятия, в которой содержатся краткие сведения и итог рассмотрения конкретного вопроса, в ней нужно указать полное наименование организации (юридического лица), дату проведения сбора, и сформулировать вопрос, который является основной темой фрагмента. При необходимости могут полностью копироваться абзацы текста, в которых приводятся принятые по вопросу решения. В юридических лицах такая форма документации используется для донесения новой информации. По сути она является основанием для изменений в производственных процессах организации и уточнения частностей. В этом случае делопроизводитель компании оформляет необходимое число копий и передает ответственным за исполнение лицам. Эти же копии впоследствии будут основным документом для контроля за исполнением принятых решений.

В отношении физических лиц фрагменты из документов, касающихся прав и законных интересов граждан, выдаются по их требованию, в порядке, установленном актуальным на сегодняшний день Указом Президиума ВС СССР от 04.08.1983 № 9779-X (ред. от 08.12.2003) «О порядке выдачи и свидетельствования предприятиями, учреждениями и организациями копий документов, касающихся прав граждан».

В каких случаях нужна

Чаще всего фрагменты резолюций требуются:

• для предоставления в финансовые организации;
• для ФНС или иных контролирующих органов;
• для предоставления информации участникам общества в части, их касающейся;
• при обращении заинтересованных лиц по вопросам, которые были рассмотрены.

Как написать выписку из протокола собрания

Составлением подобной документации занимается секретарь организации или сотрудник, ответственный за делопроизводство. Единого регламентированного порядка составления этого документа не разработано. Существуют лишь общепринятые правила оформления:

• начинаться она должна со слов «Выписка из протокола общего собрания…»;
• в вводной части текста указывают количество участников события и основные реквизиты протокола;
• указывается не только суть вопроса, но и его номер (пункт), под которым он фигурирует в основном документе;
• составитель — тот, кто подписывает выписку из протокола общего собрания, после текста пишет фразу «Выписка верна», расшифровывает свою подпись, должность и также указывает дату составления;
• подпись составителя и верификация дополняются печатью организации.

В документах для внутреннего пользования заверить документ может секретарь, а вот копия для внешних организаций заверяется обязательно руководством.

Копии выписок имеют разный срок хранения. В зависимости от важности затронутых во время заседания вопросов, они могут храниться от 5 до 75 лет (пункты 415 и 656 перечня, утвержденного Приказом Минкультуры России от 25.08.2010 № 558).

срок действия, образец, как выглядит

И сегодня мы узнаем, какова форма выписки из протокола, как проходит ее оформление, и что для этого потребуется.

Общая информация

Понятие и особенности выписки из протокола

Выписка из протокола — копия его отдельных частей, сформированная и заверенная установленный образом. В законодательстве нет особых норм, регулирующих порядок составления выписки. Часто правила по подготовке, оформлению и заверению документа содержатся в локальных нормах — принятых в организации инструкциях по делопроизводству. Если таких нет, руководствуются:

• ГОСТ Р 7.08-2013. В нем есть определение понятия «выписка из документа», которое применяется в отношении выписки из протокола;
• ГОСТ Р 6.30-2003. Включает правила оформления документов, в том числе порядок заверения, внесения реквизитов;
• действующим до сих пор Указом Президиума ВС РФ СССР № 9779-X от 04.08.1983. Он определяет, что выписка из документов (в т. ч. протоколов) должна выдаваться по требованию любого гражданина или организации, чьи права затронуты обозначенными там решениями;
• нормами, регулирующими деятельность разных юридических лиц. В отношении ООО к таким относится, например, ФЗ № 14 от 08.02.1998 г.

Заполнение документа

ГОСТом рекомендовано делать выписку на фирменном бланке организации. Она состоит из нескольких частей:

• вводной (наименование, дату и место проведения собрания, список присутствующих с распределением по ролям, отметку о кворуме). Воспроизводится в соответствии с протоколом;
• основной — нужные абзацы из повестки дня, разделы «СЛУШАЛИ», «ВЫСТУПИЛИ»;
• результирующей части (решение) из раздела «ПОСТАНОВИЛИ»;
• блок «Подписи»: перечень участников, подписавших протокол, их ФИО.

В конце синей шариковой или гелиевой ручкой проставляется заверение.

Выписка из протокола общего собрания трудового коллектива о награждении (ее образец) доступен для просмотра ниже, скачать его можно здесь.

Выписка из протокола общего собрания трудового коллектива о награждении

Скачать выписку из протокола педагогического совета (ее образец) можно здесь.

Выписка из протокола педсовета (образец)

Выписка из протокола профсоюзного собрания также доступна для скачивания.

Выписка из протокола профсоюзного собрания (образец)

Выписка из протокола заседания аттестационной комиссии также доступна для скачивания.

Выписка из протокола заседания аттестационной комиссии

Функции

Выписка необходима для предоставления заинтересованным сторонам, контрагентам, государственным структурам. Чаще всего ее оформляют в двух случаях:

• в протоколе содержится информация, представляющая коммерческую или личную тайну;
• полный текст протокола слишком большой.

Выписки, посвященные какому-либо решению, могут рассылаться заинтересованным сторонам (работникам, филиалам организации). Часто таким образом руководство доносит предписания и приказы до исполнителей.

О том, как оформить выписку из протокола, читайте ниже.

Порядок получения документа

Составление

Протокол подшивается в тетрадь и хранится в архиве организации. Выписки из него готовит секретарь по запросу заинтересованного лица, он же чаще всего ее заверяет (если в уставе не определено иное).

Как правильно составить выписку:

• Вводная часть воспроизводится, как в протоколе. Проставляется дата, место, наименование документа («Выписка из протокола общего собрания ООО «Цветочек» № XX»). Указываются председатель, секретарь, присутствующие на заседании участники. Особо отмечается, есть ли кворум.
• Основная часть включает цитату из повестки дня с указанием порядкового номера в очереди вопросов. Далее иду разделы «СЛУШАЛИ» (ФИО докладчика), «ВЫСТУПАЛИ» (имена тех, кто высказывался по вопросу).
• Резолютивная часть — принятое решение («ПОСТАНОВИЛИ»).
• Перечень участников, подписавших протокол, без проставления реальных автографов (необходимо заменить на слова «Личная подпись»), напротив — их ФИО.

Заверение

Заверение необходимо для того, чтобы выписка получила юридическую значимость. Оно оформляется согласно ГОСТ Р 6.30-2003. Секретарь или иное должностное лицо, уполномоченное подписывать документы, вносит:

• слово «Верно»;
• должность составителя;
• подпись и расшифровку;
• дату составления и заверения;
• пометку, где находится оригинал протокола.

Если выписка предназначена для предоставления в стороннюю организацию, проставляют печать. Ее нужно ставить так, чтобы частично покрывать должность и роспись составителя.

Выписку готовят как в отношении одного вопроса, так и нескольких. Она бесплатна; срок изготовления зависит от того, кто заверяет документ. В некоторых организациях принципы ведения делопроизводства определены в локальных инструкциях. Иногда лица, имеющие право заверения, прописаны в уставе. Ими могут быть генеральный директор, руководитель подразделения, председатель правления.

Важная информация

1. Есть ли разница между выписками из протокола собраний коммерческой или некоммерческой организации (педсовета, СНТ)? Выписки из протокола составляются унифицированным образом. Разница может заключаться в специфике самого протокола. Например, если уставом определено правило ведения подробного документирования, помимо основных разделов могут быть приведено обсуждение вопроса: реплики, особые мнения, ход голосования. На оперативных или внеплановых собраниях ведут краткий протокол, поэтому выписка может не содержать раздел «ВЫСТУПИЛИ», а только «СЛУШАЛИ» и принятое решение.
2. Нужно ли заверять выписку у нотариуса? Практика показывает, что финансовые и государственные структуры (налоговая и ПФР) часто требуют нотариального заверения выписок по примеру протоколов. Согласно ФЗ № 14, документирование хода собрания ООО должно быть удостоверено присутствующим на нем нотариусом, если в уставе не прописан иной порядок. Обязательно заверение протокола, если решения касаются финансовых вопросов деятельности ЮЛ или смена руководства. Не каждый нотариус готов заверить выписку, если он не следил за ходом заседания. Те, кто соглашаются, требуют оригинал протокола, в котором удостоверены подписи участников. Даже если в уставе прописан договорной порядок принятия решений, при обсуждении важных вопросов рекомендуется приглашать нотариуса. В спорных ситуациях можно сослаться на устав, в котором прописано проведение собраний без юриста, и определено должностное лицо, имеющее право заверять документы.

образец и порядок составления, кто ее подписывает

Юридические лица, созданные на основании членства в них граждан и иных организаций, решают основные вопросы деятельности на общем собрании участников, которое является высшим органом управления. Уставами или положениями устанавливается его компетенция и определяется, решения по каким вопросам правомочны принимать все участники.

К таким организациям, образованным по принципу членства, относятся хозяйственные общества, наиболее распространенными из них являются акционерные и общества с ограниченной ответственностью, а также некоммерческие объединения граждан и юридических лиц: всевозможные ТСЖ, СНТ, ЖСК, некоммерческие партнерства, ассоциации и союзы.

Содержание статьи

Порядок проведения

Как правило, на общем собрании большинством голосов принимаются решения:

• о создании, реорганизации, ликвидации ООО;
• утверждение устава и внесение в него изменений;
• участие в других юридических лицах;
• образование исполнительных органов и выборы органов управления;
• утверждение годового отчета;
• назначение ревизионной или аудиторской проверки.

Инициатива созыва собрания принадлежит исполнительному органу или группе участников, числом не менее определенного процента от их числа согласно учредительным документам. Процедура должна отвечать требованиям закона, регулирующего деятельность организации, и устава. Всем членам заблаговременно должно быть выслано уведомление, содержащее дату, время, место проведения и повестку дня.

В целях проверки правомочности собрания и наличия кворума рекомендуется проводить регистрацию прибывших с указанием документа, удостоверяющего личность, и проставлением подписи участника напротив своей фамилии.

Собрание в самом начале должно выбрать председательствующего, на которого возлагается его проведение, и секретаря для ведения протокола.

В протоколе должен быть отражен весь его ход, выступления участников, прения, обсуждения вопросов повестки, голосование и его результаты, принятые решения:

• Во вводной части указывается дата начала и окончания сбора, количество лиц, принимающих в нем участие, процентное соотношение прибывших к общему количеству членов организации, наличие или отсутствие кворума, а также вопросы, включенные в повестку.
• В основной части описывается последовательность рассмотрения вопросов, при этом можно составить краткий протокол с фиксацией пункта повестки и принятого решения или полный с записью речей докладчиков, реплик, мнений.

По окончании собрания составляется официальный протокол на основании записей, которые вел избранный секретарь. Срок его изготовления обычно – от 3 до 5 дней. Изготовленный документ подписывается председательствующим и секретарем и хранится вместе со всей документацией сбора: уведомлением, листом регистрации, черновыми записями о ходе обсуждений.

Ненадлежащее составленный протокол может быть основанием для признания принятого решения недействительным.

Собрания участников могут проводиться путем заочного голосования, без созыва всех членов организации. В таких случаях инициаторы уведомляют в обычном порядке о созыве и порядке принятия решений по вопросам повестки. Голосование проводится путем заполнения высланных организатором бюллетеней в течение определенного срока. По итогам подсчета голосов, отраженных в бюллетенях, составляется протокол. Такая форма голосования может быть применена и в обычных очных сборах в целях исключения факта отказа участником от выраженного мнения.

Для АО и ООО законодательством предусмотрено нотариальное удостоверение принятых решений. Но если в уставе установлено, что протокол должен быть подписан всеми участниками лично или с использованием электронной подписи, позволяющей достоверно установить волю голосовавшего, то можно не привлекать нотариуса.

Что собой представляет выписка?

Выписка из протокола – это точная его копия по конкретному вопросу или части. Правом требовать ее обладает любой член организации либо его уполномоченный представитель. Органы управления при получении запроса обязаны предоставить документ в разумный срок, как правило, не превышающий 7 дней.

Выписку не нужно путать с ксерокопией, поскольку это отдельный документ, и составляется он в том же порядке, что и сам протокол с указанием присутствовавших, повестки, обсуждения по конкретному вопросу и принятому решению.

Заверяет ее руководитель организации в лице директора, председателя правления или председателя совета партнерства и скрепляет печатью.

На документе ставится отметка «верно», подпись и должность заверяющего лица и дата составления. Он предоставляется в тех случаях, когда на повестке собрания было большое количество вопросов и протокол содержит большое количество информации, не относящейся к правам лица, требующего его выдачи.

Общее собрание акционеров

Деятельность акционерных обществ регулируется федеральным законом, который содержит требование по раскрытию информации, в том числе и о проведении общего собрания, путем опубликования в течение 2 дней с даты составления протокола в сети интернет.

В случае нарушения указанной нормы общество может быть привлечено к административной ответственности. Сам же документ должен быть составлен не позднее 3-х дней с даты закрытия собрания.

Публикация не лишает акционеров права требовать выписку, которую ему обязан предоставить единоличный орган управления в лице директора.

Собрание участников ООО

Законом об обществах с ограниченной ответственностью не установлен срок изготовления протокола, но он может быть предусмотрен в уставе. В документе, помимо информации, указанной выше, обязательно должны быть отражены результаты голосования с указанием количества голосовавших за принятие решения, против и воздержавшихся.

В течение 10 дней с даты оформления итогов собрания они должны быть направлены всем участникам, в противном случае органы управления могут быть привлечены к административной ответственности. Выписку также может требовать любой участник.

Подробнее о том, как провести данное собрание, смотрите на следующем видео:

Собрание некоммерческих организаций

Законодательство не содержит строгих требований к составлению протокола общего собрания различных товариществ и некоммерческих партнерств, в форме которых создаются СРО – профессиональные объединения.

Обязанность ведения документа предусмотрена законом и внутренними документами, уставом и положениями.

После проведения собрания протокол, в котором отражены все рассмотренные вопросы и принятые решения, подписывается председателем и секретарем и хранится у руководства. Выписка может быть предоставлена любому члену организации.

В случае сомнений в ее подлинности у третьих лиц, для представления которым участник ее затребовал, может быть истребована копия протокола, заверенная единоличным исполнительным органом.

образец по трудовому коллективу и ООО, реквизиты

Общее собрание участников проводится юридическими организациями, которые основаны на участии в них других людей. Именно эти собрания и становятся своеобразным высшим органом управления. Компетенция этого органа определяется уставами и положениями. Среди важных документов и выписки из протоколов.

О порядке проведения собраний

Общие собрания проводятся для того, чтобы принять решение по важным вопросам, которые касаются всех:

• Назначение проверки, аудиторского или ревизионного характера.
• Утверждение отчёта за целый год.
• Выборы в органы управления, образование исполнительных органов.
• Принятие участия в образовании других юридических лиц.
• Утверждение Устава, либо изменение.
• Ликвидация ООО, создание или реорганизация.

Обычно собрания организуются собственниками ООО. Или группой участников, которых не менее определённого процента от других участников, согласно учредительным документам. Устав и законодательство, регулирующее деятельность общества – главные документы, на которые надо опираться при проведении собраний.

Уведомление с информацией о дате и времени проведения заблаговременно отправляется каждому из участников.

Кто такие индоутки и как превратить их разведение в свой бизнес, вы узнаете по ссылке.

Правила создания протокола

Отдельно во время проведения собраний выбирают секретаря, который ведёт протокол.

В протоколе отражается ход ведения собрания. А так же – выступления участников вместе с прениями, обсуждениями вопросов на повестке, голосованием и результатами. Принятые решения так же описываются как можно точнее.

1. О дате, когда собрание началось и закончилось, пишут в вводной части. Здесь пишут о количестве лиц, принявших участие. И процентное отношение тех, кто был на собрании к общему количеству участников. Обязательно указывается наличие или отсутствие кворума. И информация о вопросах, поставленных на повестку.
2. Основная часть посвящена последовательности решения каждого вопроса. Запись по ним может быть краткой, либо иметь полную форму.

Официальный протокол в полной форме составляется только после того, как собрание было проведено. Его основа – записи, составленные секретарём. На изготовление документа уходит не больше 3-5 дней. Председательствующий и секретарь обязательно ставят свои подписи на документе.

Что такое форма Р26001 и зачем она вам может понадобиться? Всю информацию вы найдете тут.

Он хранится вместе с другими бумагами, которые касаются собрания. Принятое решение могут признать недействительным, если протокол составлен не по правилам действующего законодательства.

Можно организовать заочное голосование, не приглашая всех членов общества. Тогда уведомления направляются не только о проведении собрания, но и о решениях, которые были приняты.

Для проведения голосования участники организации должны заполнить опросные листки на протяжении некоторого срока.

Протокол составляется после подсчёта голосов в этих документах. Нотариальное удостоверение принятых решений предусмотрено только для форм собственности вроде ООО и АО.

Что такое выписки, зачем они нужны?

Выписка из протоколов представляет собой точную копию самого протокола. Только не полностью, а конкретной его части, отдельного вопроса. По первому требованию выписку выдают участникам за срок, обычно не превышающий семи дней.

Живете в деревне и хотите заняться разведением животных, чтобы это еще и приносило стабильный доход? Статья Разведение цесарок, как бизнес: что нужно знать? расскажет, как это сделать.

Выписка не равна ксерокопии, она является отдельным документом. Составляется она в том же порядке, что и сам протокол.

Составляем выписку из собрания трудового коллектива

В данном случае существует всего несколько правил заполнения выписки из собрания трудового коллектива.

• Сначала дают название самому документу.
• Потом вставляют вводную часть из самого протокола.
• Далее идёт отдельный пункт, процитированный из общей повестки.
• Основной текст выписки формируется копированием необходимого отрывка в основном документе.
• Важны ссылки на лиц, подписавших договор. И их должности.
• Последний этап – заверение документа.

При проведении общего собрания ООО

Здесь так же используются фрагменты, которые присутствовали в самом протоколе.

Основные принципы составления будут такими.

1. Начинают с оформления заголовка.
2. Копируются все реквизиты, перечисленные в протоколе.
3. Далее пишут о количестве тех, кто принял участие в собрании.
4. Переходят к копированию пункта протокола, интересующего посылавшего запрос.
5. Далее идёт основная часть обсуждения по тому или иному вопросу.
6. Следующий – пункт, касающийся принятого решения.
7. Ссылка на лиц, заполнивших протокол.
8. Заверение документа лицом с соответствующими полномочиями.

Становитесь ИП, значит вам надо зарегистрироваться, а как это сделать? Ответы вы найдете в этой статье.

При проведении собрания акционеров

Здесь правила остаются теми же. Выписка играет просто роль копии какой-либо части основного документа. Но не всего целиком, а отдельной его части. И сама выписка оформляется отдельно.

Образец выписки из протокола можно скачать тут.

Обязательно наличие вводной части, включая описание повестки дня. Только после этого идёт дословное содержание абзацев, интересующих заявителя в той или иной ситуации. Обязательным становится наличие информации о том, где и когда проводилось собрание.

Как быть некоммерческим организациям?

И здесь правила остаются почти одинаковыми. Начинается всё с вводной части, после которой идёт основная. В этой основной части перечисляют вопросы из повестки дня.

Обязательно надо указать о том, каким образом проводится голосование.

Где и как, с использованием каких материалов. Можно полностью скопировать то, что было написано в самом протоколе. Некоммерческая организация так же должна указать своё название, в полной форме.

Кто несёт ответственность за подписание документа?

Для выписок не требуется заверения со стороны лиц, подписавших основной документ. Достаточно наличия подписи секретаря, ответственного за ведение записей.

Как заполнить и получить больничный лист, вы узнаете здесь.

Реквизит «Отметка о заверении копии» позволит наделить бумагу юридической силой. Подпись ставится вручную. Надо написать о том, что вся информация указана в документе верно, без ошибок. Подпись руководителя вместе с печатью организации нужна лишь в том случае, если выписку предоставляют специалистам в сторонних компаниях.

Заключение и дополнительные советы

По своей сути, любые выписки являются внутренними документами. Они дадут возможность для сохранения конфиденциальности по остальным вопросам, которые рассматриваются в ходе собрания, но не интересуют конкретного заявителя.

Для документа не существует унифицированной формы, на каждом предприятии разрабатывают свою собственную. Главное – соблюдать общие требования, указанные в законодательстве.

Разъяснения и дополнения в выписках отсутствуют. Они должны быть посвящены только одному конкретному вопросу. Только в этом случае документ можно заверить и сделать так, чтобы он обладал юридической силой.

Наняли экономиста, а теперь столкнулись с необходимостью составления должностной инструкции? Как это правильно сделать и что должен в себя включать такой документ, вы узнаете по ссылке.

Для получения выписок на предприятиях рекомендуется обратиться к секретарю. Именно они отвечают за оформление, заверение документов. Иногда за оформление отвечают другие службы, если должность секретаря не оформлена соответствующим образом.

Главное, чтобы у них были полномочия по составлению и хранению отчётной документации. Например, это может быть отдел кадров.

Сами протоколы хранятся в зависимости от того, как ведётся делопроизводство на том или ином предприятии. Один из самых удобных способов – централизованный, когда за хранение отвечает секретарь, либо отдел кадров.

Подробнее о протоколе собрания учредителей вы узнаете в этом видео: 

Выписка из протокола общего собрания, выписка из протокола образец, выписка из протокола собрания, Вопросы и ответы

___________________________________________________________________________________________________________________________________________

ВЫПИСКА ИЗ ПРОТОКОЛА ОБРАЗЕЦ 

                             ОБРАЗЕЦ

     Выписки из протокола заседания Консультационного совета

    по промышленно-производственным особым экономическим зонам

                 от «__» ________ 20__ г. № _____

Место проведения заседания _______________________________________

                                                                  (почтовый адрес)

Присутствовали:

Члены Консультационного совета __________________________________;

                                                                      (фамилия, инициалы)

                               __________________________________.

                                  (фамилия, инициалы, должность

                                    и место работы других лиц)

Повестка дня:

__________________________________    ___________________________.

    (тема доклада/выступления)            (фамилия, инициалы)

Консультационный   совет  по  промышленно-производственным  особым

экономическим   зонам,   действующий   на  основании  Положения  о

Консультационном  совете  по  промышленно-производственным  особым

экономическим   зонам,  утвержденного  Приказом  Минэкономразвития

России  от  26  июня  2006  г.  № 161,  на своем заседании провел

экспертную      оценку          бизнес-плана               проекта

__________________________________________________________________

                  (полное наименование проекта)

_________________________________________________________________,

представленного __________________________________________________

                  (полное наименование коммерческой организации)

для         заключения         соглашения         о        ведении

промышленно-производственной  деятельности  в особой экономической

зоне     промышленно-производственного    типа    на    территории

______________________________________________________________, на

        (наименование субъекта РФ, области, города)

соответствие критериям, установленным Министерством экономического

развития  и торговли Российской Федерации (Приказ от 23 марта 2006

г. № 75), и условиям заявки (от 2 июня 2006 г.),

    считает, что _________________________________________________

__________________________________________________________________

    (заключение относительно соответствия бизнес-плана проекта

__________________________________________________________________

            установленным критериям и условиям заявки)

__________________________________________________________________

__________________________________________________________________

__________________________________________________________________

    Итоговая  оценка представленного бизнес-плана — __ балл(а/ов).

    Исходя из вышеизложенного,  комиссия Консультационного  совета

рекомендует _____________________________________________________.

                (поддержать/отказать в поддержке бизнес-плана)

    Данное решение принято _______________________________________

                             (единогласно/большинством голосов)

_________________________________________________________________.

Должность ответственного лица    _________     ____________

                                                  Ф.И.О.

Ответственный секретарь          _________     ____________

                                                  Ф.И.О.

срок действия, образец, как выглядит в 2019

С помощью протокола документируют происходящее на собрании или заседании. В организации, созданной на основе членства участников — физических и юридических лиц — коллегиальные решения обязательны для исполнения. Собрание как высший орган управления существует в коммерческих (ООО, АО, ПАО) и некоммерческих (педсовет, профсоюз, садовое товарищество, родительский комитет, ТСЖ и др.) учреждений. Протокол может содержать несколько листов текста. Если необходимо донести какое-либо из принятых решение до заинтересованной стороны, используют выписки из него.

И сегодня мы узнаем, какова форма выписки из протокола, как проходит ее оформление, и что для этого потребуется.

После прочтения статьи у вас остались вопросы? Задайте вопрос прямо сейчас через форму (внизу), и в течение часа профильный специалист перезвонит вам, чтобы оказать бесплатную консультацию.

Общая информация

Понятие и особенности выписки из протокола

Выписка из протокола — копия его отдельных частей, сформированная и заверенная установленный образом. В законодательстве нет особых норм, регулирующих порядок составления выписки. Часто правила по подготовке, оформлению и заверению документа содержатся в локальных нормах — принятых в организации инструкциях по делопроизводству. Если таких нет, руководствуются:

• ГОСТ Р 7.08-2013. В нем есть определение понятия «выписка из документа», которое применяется в отношении выписки из протокола;
• ГОСТ Р 6.30-2003. Включает правила оформления документов, в том числе порядок заверения, внесения реквизитов;
• действующим до сих пор Указом Президиума ВС РФ СССР № 9779-X от 04.08.1983. Он определяет, что выписка из документов (в т. ч. протоколов) должна выдаваться по требованию любого гражданина или организации, чьи права затронуты обозначенными там решениями;
• нормами, регулирующими деятельность разных юридических лиц. В отношении ООО к таким относится, например, ФЗ № 14 от 08.02.1998 г.

Заполнение документа

ГОСТом рекомендовано делать выписку на фирменном бланке организации. Она состоит из нескольких частей:

• вводной (наименование, дату и место проведения собрания, список присутствующих с распределением по ролям, отметку о кворуме). Воспроизводится в соответствии с протоколом;
• основной — нужные абзацы из повестки дня, разделы «СЛУШАЛИ», «ВЫСТУПИЛИ»;
• результирующей части (решение) из раздела «ПОСТАНОВИЛИ»;
• блок «Подписи»: перечень участников, подписавших протокол, их ФИО.

В конце синей шариковой или гелиевой ручкой проставляется заверение.

Выписка из протокола общего собрания трудового коллектива о награждении (ее образец) доступен для просмотра ниже, скачать его можно здесь.

Выписка из протокола общего собрания трудового коллектива о награждении

Скачать выписку из протокола педагогического совета (ее образец) можно здесь.

Выписка из протокола педсовета (образец)

Выписка из протокола профсоюзного собрания также доступна для скачивания.

Выписка из протокола профсоюзного собрания (образец)

Выписка из протокола заседания аттестационной комиссии также доступна для скачивания.

Выписка из протокола заседания аттестационной комиссии

Функции

Выписка необходима для предоставления заинтересованным сторонам, контрагентам, государственным структурам. Чаще всего ее оформляют в двух случаях:

• в протоколе содержится информация, представляющая коммерческую или личную тайну;
• полный текст протокола слишком большой.

Выписки, посвященные какому-либо решению, могут рассылаться заинтересованным сторонам (работникам, филиалам организации). Часто таким образом руководство доносит предписания и приказы до исполнителей.

О том, как оформить выписку из протокола, читайте ниже.

Не обязятельно искать ответ на свой вопрос в этой длинной статье! Напишите свой вопрос через форму (внизу), и наш юрист перезвонит вам в течение 5 минут, бесплатно проконсультирует.

Порядок получения документа в 2019

Составление

Протокол подшивается в тетрадь и хранится в архиве организации. Выписки из него готовит секретарь по запросу заинтересованного лица, он же чаще всего ее заверяет (если в уставе не определено иное).

Как правильно составить выписку:

• Вводная часть воспроизводится, как в протоколе. Проставляется дата, место, наименование документа («Выписка из протокола общего собрания ООО «Цветочек» № XX»). Указываются председатель, секретарь, присутствующие на заседании участники. Особо отмечается, есть ли кворум.
• Основная часть включает цитату из повестки дня с указанием порядкового номера в очереди вопросов. Далее иду разделы «СЛУШАЛИ» (ФИО докладчика), «ВЫСТУПАЛИ» (имена тех, кто высказывался по вопросу).
• Резолютивная часть — принятое решение («ПОСТАНОВИЛИ»).
• Перечень участников, подписавших протокол, без проставления реальных автографов (необходимо заменить на слова «Личная подпись»), напротив — их ФИО.

Заверение

Заверение необходимо для того, чтобы выписка получила юридическую значимость. Оно оформляется согласно ГОСТ Р 6.30-2003. Секретарь или иное должностное лицо, уполномоченное подписывать документы, вносит:

• слово «Верно»;
• должность составителя;
• подпись и расшифровку;
• дату составления и заверения;
• пометку, где находится оригинал протокола.

Если выписка предназначена для предоставления в стороннюю организацию, проставляют печать. Ее нужно ставить так, чтобы частично покрывать должность и роспись составителя.

Выписку готовят как в отношении одного вопроса, так и нескольких. Она бесплатна; срок изготовления зависит от того, кто заверяет документ. В некоторых организациях принципы ведения делопроизводства определены в локальных инструкциях. Иногда лица, имеющие право заверения, прописаны в уставе. Ими могут быть генеральный директор, руководитель подразделения, председатель правления.

Узнайте, как решить именно вашу проблему. Напишите свой вопрос через форму (внизу), и один из наших юристов перезвонит вам, чтобы оказать бесплатную консультацию.

Важная информация в 2019

1. Есть ли разница между выписками из протокола собраний коммерческой или некоммерческой организации (педсовета, СНТ)? Выписки из протокола составляются унифицированным образом. Разница может заключаться в специфике самого протокола. Например, если уставом определено правило ведения подробного документирования, помимо основных разделов могут быть приведено обсуждение вопроса: реплики, особые мнения, ход голосования. На оперативных или внеплановых собраниях ведут краткий протокол, поэтому выписка может не содержать раздел «ВЫСТУПИЛИ», а только «СЛУШАЛИ» и принятое решение.
2. Нужно ли заверять выписку у нотариуса? Практика показывает, что финансовые и государственные структуры (налоговая и ПФР) часто требуют нотариального заверения выписок по примеру протоколов. Согласно ФЗ № 14, документирование хода собрания ООО должно быть удостоверено присутствующим на нем нотариусом, если в уставе не прописан иной порядок. Обязательно заверение протокола, если решения касаются финансовых вопросов деятельности ЮЛ или смена руководства. Не каждый нотариус готов заверить выписку, если он не следил за ходом заседания. Те, кто соглашаются, требуют оригинал протокола, в котором удостоверены подписи участников. Даже если в уставе прописан договорной порядок принятия решений, при обсуждении важных вопросов рекомендуется приглашать нотариуса. В спорных ситуациях можно сослаться на устав, в котором прописано проведение собраний без юриста, и определено должностное лицо, имеющее право заверять документы.

Простой метод фракционированной экстракции для комплексного анализа метаболитов, липидов и белков из одного образца

В этой статье мы описываем и проиллюстрируем простой и весьма применимый протокол экстракции для комплексного липидомного, метаболомного и протеомного анализа из одного 50 мг образца листа. Этот метод ранее использовался в нескольких исследованиях, которые были опубликованы в различных статьях ^{17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 31 , 32 , 33, 33, 33, 33, 33 35 , 36 , 37} и доказал свою надежность, надежность и воспроизводимость в дополнение к простому рабочему процессу и высокой применимости.

Приведенные здесь приложения демонстрируют некоторые стандартные методы первоначального скрининга сложного биологического образца. Эти иллюстрированные крупномасштабные метаболомные и липидомные наборы данных могут предоставить исчерпывающую информацию о широких или конкретных изменениях метаболизма анализируемой биологической системы, в то время как данные, полученные в результате анализа белков, дают представление о количественных (изобилие) и качественных (модификации) ) изменения ферментов, структурных белков или факторов транскрипции (TF), контролирующих клеточные функции и механизмы.Соответственно, данные интегративной омики могут раскрыть исходную информацию о возможных изменениях, вызванных генетическими или биотическими и / или абиотическими нарушениями биологической системы, путем выяснения молекулярных изменений различных молекул, связанных с конкретными метаболическими путями или клеточными процессами.

Конечно, в долгосрочной перспективе для успешного анализа системной биологии очень важно максимизировать количество анализируемых и аннотированных молекулярных объектов, позволяя максимально полно контролировать клеточные функции и активность.Для этой цели полученные фракции могут быть дополнительно применены к различным аналитическим методам, нацеливаясь на другие соединения или классы соединений ( Рисунок 4 ).

Сказав это, следует упомянуть, что глобальная стратегия анализа полученных данных может быть реализована двумя разными стратегиями: с одной стороны, мы делаем упор на выяснение клеточных функций путем количественной оценки известных соединений. С другой стороны, многие из измеренных метаболитов и липидов еще не известны и не аннотированы.Эти еще не аннотированные измерения соединений также содержат много значимой информации, которую можно использовать статистическими методами для классификации или различения групп или обработок ^{20 , 21 , 22} .

Тем не менее, эти неизвестные соединения, особенно те, которые имеют отношение к групповой классификации или служат биомаркерами, нуждаются в идентификации. К сожалению, этот процесс идентификации довольно утомителен и не может быть достигнут без дополнительных аналитических измерений или стратегий ³⁸ .Как видно из Рисунок 4 , количество неаннотированных соединений довольно велико (фактически подавляющее большинство). Тем не менее, как упоминалось выше, с этими хроматографическими пиками можно обращаться в рамках анализа данных, и, следовательно, существенно затронутые сущности могут быть выявлены и подвергнуты дальнейшим стратегиям идентификации.

Таким образом, мы можем сделать вывод, что представленный здесь протокол обеспечивает несколько преимуществ для экспериментальной системной биологии, а также для классических статистических приложений.

Во-первых, поскольку все фракции извлекаются из одного образца, различия между различными наборами экспериментальных данных (липиды, метаболиты, белки) значительно уменьшаются, поскольку каждый набор данных получен из одной и той же аликвоты образца. Это явно приводит к повышению сопоставимости полученных результатов.

Во-вторых, метод легко масштабируется и поэтому хорошо совместим с небольшими и большими объемами проб. Мы обычно используем 10–100 мг образцов тканей, но успешные липидомные исследования были проведены всего на 20 семенах Arabidopsis ³¹ .В частности, совместимость с небольшими количествами образцов делает этот метод применимым, если доступно ограниченное количество биологических тканей или образцов. Тем не менее, даже при наличии достаточного количества материала образца, представленный здесь метод предлагает преимущество использования этих образцов в большем количестве экспериментальных повторов вместо их использования для различных процедур экстракции. Это позволяет проводить более точный статистический анализ данных.

В-третьих, поскольку метод основан на жидкостно-жидкостном фракционировании полярных и неполярных молекул, он обеспечивает, в отличие от простых однофазных методов экстракции ( e.грамм. метанольных экстрактов), значительный этап процесса разложения комплекса. Это эффективное удаление комплекса из образца приводит к частичной очистке отдельных фракций из-за отделения друг от друга химически мешающих молекул. Соответственно, процесс химического разделения не только обеспечивает практическое преимущество для систематического разделения экстрагированных проб на различные химические классы, но также улучшает индивидуальные аналитические измерения, поскольку он удаляет загрязняющие соединения из различных фракций.Ясно, что мы можем наблюдать, что особенно липиды, которые разделены на органическую фазу и которые обычно отрицательно влияют на хроматографический анализ полярных соединений, будут почти полностью отсутствовать в полярной фракции. То же самое верно и для анализа гидрофобных липидов, которые будут обеднены полярными соединениями. Помимо очистки полярных и неполярных соединений друг от друга, мы истощаем и собираем белки и другие макромолекулы из образца, что не только дает отдельную фракцию, которую можно использовать для анализа белков, крахмала и клеточной стенки ¹⁶ , но также позволяет получить более чистый образец в отдельных фракциях.Это особенно актуально, поскольку известно, что присутствие крупных макромолекул приводит к повреждению или, по крайней мере, сокращению срока службы аналитических колонок.

И последнее, но не менее важное: описанный метод экстракции МТБЭ, который основан на менее опасном и более благоприятном растворителе, заменяющем хлороформ ¹⁵ , уже был продемонстрирован в нескольких исследованиях нашей группы, как широко применимый для различных биологических образцов с растений ¹⁶ , водоросли ^{17 , 18} , мухи ¹⁹ , а также несколько тканей, органов или клеток млекопитающих ^{20 , 21 , 22} .

Протоколы экстракции ДНК | McCouch RiceLab

I. Протокол экстракции гомогенизатора HT

II. Протокол крупномасштабной экстракции ДНК

III. Протокол Extract-N-Amp

A. Материалы и реагенты

1. Материалы

• а. Три бокса для 96-луночных пробирок для каждого набора из 96 образцов
• г. Две пробирки для хранения ДНК с крышками, для каждого образца
• г. 1 шарик из нержавеющей стали на образец, для каждой измельчающей трубки
• г.Ножницы и / или пинцет для сбора тканей
• e. Рабочий лист карты планшета для записи идентификатора образца для каждой лунки / пробирки
• ф. Ведро для льда или контейнер из пенополистирола со льдом, сухим льдом или жидким азотом
• г. Крупные и мелкие ступки для взвешивания ящиков с трубами в водяной бане.
• ч. Бумажные полотенца
• я. HT Гомогенизатор для измельчения тканей
• Дж. Водяная баня, температура 65 ° C
• к. Центрифуга, оснащенная поворотным ковшовым ротором A-2-DWP для 96-луночных планшетов / коробок
• л.Морозильная камера, -20˚C
• г. Инкубатор, температура 37C

2. Реагенты

• а. Лед, сухой лед или жидкий азот
• г. Буфер для экстракции

• i. 100 мМ Трис-HCl pH 8
• ii. 50 мМ ЭДТА, pH 8
• iii. 500 мМ NaCl
• iv. 1,25% SDS (мас. / Об.)
• об. 8,3 мН NaOH
• vi. 0,38 г бисульфата натрия (на 100 мл буфера) *
• * добавить непосредственно перед использованием

• г. 24: 1: Хлороформ: изоамиловый спирт
• г.Изопропанол
• e. 70% этанол об / об
• ф. Буфер TE, ph 8

B. Процедура

1. Пометьте коробку с 96-луночной пробиркой для ориентации.

2. Поместите 96-луночный бокс, содержащий по одному bb из нержавеющей стали, в каждую пробирку в коробке со льдом, толкая лед вверх по бокам, чтобы охладить пробирки. (Вы можете положить его в ящик с небольшим количеством жидкого азота или ящик с небольшим количеством сухого льда.)

3. Возьмите таблицу с 96-луночной сеткой и сориентируйте ее так же, как планшет.Наклейте этикетку по мере заполнения поля.

4. Вырежьте образец рисового листа размером 3–4 см, сложите его пополам и сдвиньте пинцетом примерно на 5 мм выше bb. Не кладите салфетку вертикально (BB просто пройдет мимо нее при встряхивании. Ткань должна перекрывать путь BB, но не плотно).

5. Плотно наденьте колпачки на пробирки и бумажное полотенце, сложенное втрое поверх колпачков, затем накройте крышкой. (Плотно заклейте скотчем.)

6. Переходите ко второму этапу или сохраняйте при –20, пока вы не будете готовы измельчить ткань.

7. Поместите вашу тарелку (и) в неглубокий контейнер с жидким азотом (не погружайте тарелку — в ящике должно быть около 1 дюйма азота).

8. Используйте пустой 96-луночный бокс и крышку, чтобы отрегулировать герметичность геногриндера, пока ваш бокс остывает.

9. Установите коробку (с очень плотными крышками и крышкой) на гомогенизатор и зафиксируйте ее на месте.

10. Закройте крышку машины и заблокируйте ее. Включите машину на 2 минуты на настройке 8.

11. Выключите машину и снимите коробку.Убедитесь, что шлифование завершено. (примечание: если снова попытаться измельчить, коробка может треснуть !!)

12. Если некоторые из ваших образцов не измельчились, используйте пару металлических пинцетов, чтобы раздавить образец (сначала вы должны повторно заморозить в азоте). Обязательно очищайте щипцы между каждым образцом, чтобы избежать загрязнения.

** примечание: каждый образец измельчается редко. Обычно есть один или два, которые вам нужно сделать вручную. Скорее всего, это результат неправильного размещения образца ткани.**

13. Храните коробки в морозильной камере (-20 ° C) до тех пор, пока они не будут готовы к экстракции.

** примечание: на этом этапе у вас должно быть две коробки — разделите образцы, если у вас только одна коробка. (следите за порядком!) Вы должны сделать это, чтобы иметь возможность центрифугировать (вы можете создать пустой блок баланса, если хотите, но обычно более эффективно разделить ваши образцы). **

14. Центрифугируйте коробки, чтобы ткань опустилась на дно пробирки (всего одну или две минуты на умеренной скорости).

15. Отметьте верхний (или нижний) край всех труб несмываемым маркером и отметьте, какой край вы отметили — всегда делайте это одинаково !!

* образцы должны быть при –20, не жидкими и замороженными, когда вы добавляете буфер !! *

16. Осторожно снимите колпачки, по одному ряду за раз, стараясь не «выбросить» ткань и не загрязнить другие пробирки. Отложите шапки в ведро для стирки.

17. Добавьте 400 мкл предварительно нагретого до 65 градусов буфера для экстракции в каждую пробирку с помощью многоканальной пипетки или пипетки с повторителем.

18. Наденьте чистые колпачки на пробирки, положите на них бумажное полотенце, сложенное втрое, и закройте крышку. Встряхните на вортексе, пока большая часть ткани не будет ресуспендирована. * держитесь за него, сильно прижимая крышку *.

19. Поместите ящики в водяную баню с температурой 65 градусов и сразу же положите на тарелку большой раствор, внутри которого находится маленький раствор. (бумажное полотенце должно оставаться на колпачках — постарайтесь не опускать его в воду.)

* не более 1.5 дюймов воды в ванне *

20. Дайте планшету инкубироваться примерно 30 минут. Нет необходимости встряхивать коробки в течение этого времени, если вы успешно ресуспендировали ткань с помощью вихря.

21. Выньте ящики и строительный раствор из водяной бани и положите на бумажные полотенца. Дайте им постоять около 2 минут, затем удалите небольшой раствор и дайте им постоять еще 2 минуты. К тому времени давление в трубках упадет, и вы сможете легко снять крышки.Снимите колпачки с противоположной от вас стороны, чтобы они не брызнули на вас. Остерегайтесь загрязнения и опускайте грязные колпачки в ведро для мытья.

22. В вытяжном шкафу добавьте 400 мкл смеси 24: 1: хлороформ: изоамиловый спирт в каждую пробирку.

23. Закройте пробирки новыми крышками. (очень плотно!) Добавьте сложенное втрое бумажное полотенце в каждую коробку и закройте крышку. Заклейте их скотчем (очень плотно !!)

24. Плотно удерживая две коробки вместе, осторожно переверните их в вытяжном шкафу в течение 5 минут.Если вы заметили мокрые бумажные полотенца, закройте колпачки и замените полотенца.

25. Взвесьте коробки и уравновесите их, тарировав самые тяжелые, а затем доведя партнера до нуля с помощью bb, установленного в колпачках (или бумажных полотенец). Положите 2 бумажных полотенца, сложенных втрое, на каждую тарелку и закройте крышку. Лента закрыта (убедитесь, что это не влияет на баланс коробок). Центрифугируйте планшеты при 3500 об / мин в течение 10 минут.

26. В вытяжке осторожно снимите колпачки (чтобы брызги ушли от вас).Выбросьте колпачки в ведро в вытяжке — они не будут использоваться повторно.

27. Аккуратно удалите 250 мкл верхней фазы с помощью многоканальной пипетки с наконечниками на 300 мкл. Поместите образец в новый 96-луночный планшет.

* убедитесь, что новая пластина имеет ту же ориентацию, что и исходная *

28. Обозначьте пластину линией, как вы делали в начале, и промаркируйте коробку.

29. Добавьте 2/3 объема изопропанола (комнатной температуры) в каждую пробирку для осаждения ДНК.Закройте пробирки крышкой. Уравновесить, взвесив, как описано выше, накрыть бумажным полотенцем и накрыть крышкой. Аккуратно переворачивайте, пока ДНК не выпадет из раствора. Вы можете оставить их на –20 на ночь (или на некоторое время) или можете сразу перейти к следующему шагу.

30. Центрифугируйте планшеты в течение 10 минут при 3500 об / мин.

31. В капюшоне аккуратно снимаем колпачки (подальше от себя). Вылейте жидкость в стакан, по одному ряду пробирок за раз, и осторожно постучите пробирками о бумажное полотенце. Следите за тем, чтобы гранула не выскользнула.Лучше всего это сработает, если вы без колебаний сливаете супернатант. Верните ряд трубок обратно в коробку, соблюдая правильную ориентацию.

32. Добавьте 200 мкл 70% этанола комнатной температуры в каждую пробирку и снова наденьте чистые колпачки. Осторожно постучите. Оставьте на ночь (или некоторое время) при комнатной температуре. Вы можете приступить к работе немедленно, если ваши образцы выглядят очень чистыми и чистота ваших образцов не является абсолютно критичной.

33. Слейте этанол, как и раньше, и постучите по трубкам, чтобы удалить как можно больше жидкости, не сбрасывая осадок.Вы можете центрифугировать перед этим этапом, но часто в этом нет необходимости, если только гранулы не начнут соскальзывать по стенкам пробирки во время сброса. Поместите пробирки обратно в коробки и поместите в инкубатор с температурой 37 градусов, не встряхивая, чтобы высохнуть. (это просто дует воздух.) Это займет несколько часов. В качестве альтернативы вы можете оставить их в вытяжном шкафу и включить кнопку аварийной вентиляции (пожалуйста, отключите ее). Это повысит поток воздуха и поможет им быстрее высохнуть, но это будет медленнее, чем в инкубаторе.

34. Если образцы не содержат остатков спирта, добавьте 50 мкл буфера te для концентрированного исходного раствора или 500 мкл буфера te для рабочего разведения. (они ресуспендируются быстрее, если вы нагреете буфер te до 65c.)

35. Хранить с закрытыми крышками при температуре –20 или 4 градуса Цельсия в зависимости от использования.

A. Материалы и реагенты

1. Материалы

• а. Конверты бумажные коричневые
• г. Контейнер Дьюара для жидкого азота или пенополистирола
• г.Ступка и пестик
• г. Конические пробирки 50 мл
• e. Кисть (стиль кисти)
• ф. Стеллажи на 80 пробирок
• г. Стеклянная пипетка Пастера с крючковатым наконечником
• ч. Центрифуга
• я. Дозаторы с наконечниками, включая наконечники с широким отверстием.
• Дж. Водяная баня
• к. Холодильник и морозильник (до -20 ° C)

2. Реагенты

• а. Лед, сухой лед или жидкий азот
• г. Буфер для экстракции

• i.100 мМ Трис-HCl pH 8
• ii. 50 мМ ЭДТА, pH 8
• iii. 500 мМ NaCl
• iv. 1,25% SDS (мас. / Об.)
• об. 8,3 мН NaOH
• vi. 0,38 г бисульфата натрия (на 100 мл буфера) *
• * добавить непосредственно перед использованием

• г. 24: 1: Хлороформ: изоамиловый спирт
• г. Изопропанол
• e. 70% этанол об / об
• ф. Буфер TE, ph 8

• i. 10 мМ Трис-HCl pH 8
• ii. 1 мМ ЭДТА

Б.Процедура

1. Соберите ткань:

• а. Соберите свежую ткань листьев (достаточно, чтобы сделать шар размером с яйцо).
• г. Поместите его в конверт из коричневой бумаги и погрузите в жидкий азот.
• г. Затем эту ткань можно хранить при -20 ° C или -80 ° C до тех пор, пока она не понадобится, или вы можете сразу перейти к следующему этапу.

2. Охладите ступку, поместив ее в морозильную камеру на несколько часов перед использованием или поместив в ящик с жидким азотом примерно на 5 минут.(* Будьте осторожны при извлечении его из коробки, так как он будет очень холодным — вам нужно будет вытащить его с помощью какого-нибудь инструмента.)

3. Измельчить образец:

• а. Налейте в ступку немного жидкого азота и поместите в нее один из образцов ткани.
• Протоколы экстракции ДНК из лаборатории Маккача 2 июня 2010 г.
• г. Измельчите ткань пестиком, пока она не станет тонкой порошкообразной консистенции (весь азот испарится, и вам нужно продолжить измельчение в этой точке, чтобы получить достаточно мелкую массу.)
• г. Перенесите измельченную ткань в коническую пробирку на 50 мл (помеченную и охлажденную) с помощью кисти.
• г. Положите примерно 15 мл измельченной ткани в каждую пробирку. Закройте пробирку крышкой и поместите в азот или в морозильную камеру.
• e. Быстро очистите ступку и пестик сухими бумажными полотенцами, прежде чем они начнут таять. Если они оттаивают, к ним прилипнет ткань. В этом случае можно снять ткань с помощью наждачной бумаги.
• ф. Не погружайте замороженную ступку и пестик в воду — он разобьется! Вы можете приступить непосредственно к экстракции или хранить измельченные ткани при -20 или -80 ° C.

4. Добавьте бисульфит натрия в буфер для экстракции и нагрейте до 65 ° C на водяной бане.

5. Добавьте примерно от 20 до 25 мл буфера для экстракции в каждую пробирку с измельченной тканью.

• а. Его можно добавить с помощью устройства для повторного дозирования или просто отмерив буфер в конической пробирке на 50 мл и вылив его в пробирки, содержащие ткань. Точные измерения не важны.
• г. Закройте пробирки крышкой и ресуспендируйте, осторожно постукивая (или, при необходимости, перемешивая чистой металлической лопаткой.) Ткань должна иметь температуру -20 ° C, когда вы будете готовы добавить буфер (чем холоднее, тем сложнее ресуспендировать ткань).

6. Поместите образцы в водяную баню с температурой 65 ° C примерно на 30 минут. Время от времени перемешивайте вручную.

7. Снимите образцы с температуры 65 ° C. Дайте остыть в вытяжном шкафу для химикатов в течение 10-15 минут (снятие крышек может помочь в этом).

8. Добавьте примерно 15 мл хлороформа: изоамиловый спирт, 24: 1, в каждый образец. Закройте каждую пробирку, убедившись, что крышки правильно закрыты, чтобы избежать утечки.

9. Поместите пробирки в штатив, затем поместите на них другую штатив (или другой твердый предмет), чтобы закрепить пробирки. Осторожно переверните пробирки и покачивайте взад и вперед, чтобы перемешать. Делайте это в течение полных 5 минут. Вся эта работа должна выполняться в вытяжном шкафу, поскольку хлороформ является потенциальным канцерогеном.

10. Центрифугируйте образцы в настольной центрифуге (от 2500 до 3000 об / мин в течение 10 минут).

11. Перенесите верхнюю водную фазу в новую пробирку на 50 мл.

• а.Если граница раздела между верхним водным слоем и нижним органическим слоем стабильна, верхний слой может быть перенесен путем декантации. Если нет, перенесите пипеткой.
• г. Эту работу также следует проводить в химическом вытяжном шкафу, поскольку в водном слое можно обнаружить некоторое количество хлороформа.
• г. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ЭТАП: Добавьте 10 мкл раствора РНКазы в пробирки, аккуратно перемешайте и оставьте при комнатной температуре примерно на 15 минут. Переходите к следующему шагу.

12. Добавьте 2/3 объема изопропанола в каждый образец (например,грамм. если 15 мл водной фазы переносится в новую пробирку, добавляют 10 мл изопропанола).

• а. Хорошо перемешайте, перевернув пробирку несколько раз.
• Протоколы экстракции ДНК из лаборатории Маккача 2 июня 2010 г.
• г. На этом этапе должен быть виден беловатый вязкий осадок, состоящий из ДНК и РНК.
• г. Образцы можно хранить при температуре 4 ° C или -20 ° C в течение нескольких часов или в течение ночи, чтобы способствовать осаждению или в качестве точки остановки в протоколе.В качестве альтернативы вы можете перейти непосредственно к следующему шагу.

13. Удалите осадок.

• а. Если осадок можно извлечь с помощью стеклянной пипетки Пастера, имеющей форму крючка, переходите к шагу 14.
• г. Если осадок не всплывает или не образует связную массу, его можно собрать центрифугированием, как на этапе 10. Затем переходите к этапу 14.b.

14. Ресуспендируйте осадок ДНК.

• а. Окуните ДНК на крючок в холодный 70% этанол.Он останется на крючке. Удалите его и аккуратно промокните кимвипом. (Делайте это очень осторожно, чтобы нуклеиновая кислота не прилипла к кимвипе!)
• г. Поместите почти сухой осадок в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 200–1000 мкл буфера ТЕ. (Необходимое количество TE зависит от размера осадка нуклеиновой кислоты.)
• г. * ПРИМЕЧАНИЕ. В осадке не может быть ЛЮБОГО этанола, иначе это может отрицательно повлиять на реакцию ПЦР. При необходимости дайте осадку немного посидеть в пробирке, чтобы он высох, прежде чем добавлять буфер ТЕ.Обычно при использовании этого метода в этом нет необходимости, так как кажется, что на кимвипе вытягивается достаточное количество этанола. Переходите к шагу 15.
• г. (из шага 13.b) Слейте жидкость из центрифугированной пробирки и добавьте несколько мл холодного 70% этанола.
• e. Осторожно постучите и оставьте на несколько минут до ночи при комнатной температуре, в зависимости от ваших потребностей и временных ограничений. (Если ДНК действительно выглядит «грязно», вы можете оставить ее на ночь, но обычно мы так не поступаем.Снова центрифугируйте пробирку при 2500 — 3000 об / мин, но только в течение 5 минут.
• ф. Слейте жидкость и дайте всему этанолу испариться. (Вы можете оставить трубки в вытяжном шкафу.) Это займет некоторое время! Когда гранула высохнет, добавьте 200-1000 мкл буфера ТЕ (в зависимости от размера гранулы). Используя наконечник с широким отверстием, перенесите раствор в пробирку на 1,5 мл. Переходите к шагу 15.

15. Ресуспензия может занять несколько часов, и вы можете просто оставить пробирки в холодильнике на ночь, если у вас есть время.

• а. Чтобы помочь с повторным суспендированием ДНК, буфер TE можно нагреть до 65 ° C перед добавлением к осадку.
• г. В качестве альтернативы пробирки объемом 1,5 мл, содержащие ДНК, можно немного нагреть на водяной бане при 65 ° C (не погружайте пробирки в воду, а ставьте их над водой, чтобы их окружал теплый воздух) в течение 15-30 минут. (используйте как можно меньше времени для сохранения целостности ДНК).

• Примечание: если вы добавили еще TE, и кажется, что гранулы больше не растворяются:
• Некоторые образцы могут содержать большое количество полисахаридов, которые не растворяются и могут создавать впечатление, что осадок ДНК не перешел в раствор.В этих случаях образцы следует центрифугировать на максимальной скорости (13 000 об / мин) в микроцентрифуге в течение 10 минут, а супернатант, содержащий ДНК, следует перенести в чистую пробирку.

A. Материалы и реагенты

1. Материалы

• а. 96-луночный микротитровальный планшет и пломбы
• г. Пинцет и ножницы для сбора тканей
• г. Ведро для льда или ящик из пенополистирола
• г. Термоциклер
• e. Центрифуга с ротором для микротитровальных планшетов и адаптером
• ф.-20 ˚C Морозильная камера
• г. Кормушки для раствора

2. Реагенты

• а. Лед
• г. Деионизированная дистиллированная вода (ddh3O)
• г. Буфер для экстракции Extract-N-Amp
• г. Буфер для разбавления Extract-N-Amp

B. Процедура

1. Соберите образцы ткани размером ~ 1 мм2 в 96-луночный микротитровальный планшет на льду.

2. Храните запечатанный планшет с образцами тканей при -20 ˚C до экстракции.

3. Добавьте 10 мкл экстракционного буфера Extract-N-Amp в каждую лунку тканевого планшета, убедившись, что каждый образец хотя бы частично погружен в этот буфер.Кратковременно перемешайте на вортексе, центрифугируйте в течение 10 секунд при 3000 об / мин, чтобы при необходимости погрузить образец ткани в буфер.

4. Проведите запечатанный планшет по короткой программе инкубации на термоциклере при 94 ° C в течение 10 минут.

5. Добавьте 10 мкл буфера для разведения Extract-N-Amp. Кратковременно перемешайте на вортексе, затем центрифугируйте

6. Добавьте 80 мкл ddh3O (чтобы концентрация ДНК в образце составляла 1: 4 по сравнению с исходно извлеченной ДНК из образца).

| Thermo Fisher Scientific

Первичные ткани — ценные инструменты для изучения внутриклеточных и внеклеточных маркеров, которые характеризуют болезненные состояния.Мы разработали протокол для быстрого выделения цитокинов и сигнальных молекул из интактной ткани. Этот метод предназначен для экстракции общего белка и использует неабразивный реагент для экстракции тканей. С помощью этого протокола можно извлечь образцы тканей размером всего 10 мг. Этот метод чувствителен и позволяет обнаруживать связанные с заболеванием колебания биомаркеров. Это эффективная система для извлечения белков из различных типов тканей. Сердце, легкие, почки, селезенка, мозг, печень, тимус и гладкомышечные ткани были успешно извлечены с помощью этого протокола.Приготовленные экстракты совместимы с различными иммуноанализами, такими как ELISA и Invitrogen ™ Luminex ™, а также со всеми традиционными анализами белка. Наш метод экстракции недорогой, универсальный и может быть выполнен менее чем за 15 минут. Мы предлагаем буфер для экстракции клеток для экстракции общего белка из различных типов тканей.

Приготовьте 1x буфер для экстракции клеток, используя следующий состав:

Состав буфера для экстракции клеток

* 10 мМ Трис, pH 7.4
* 2 мМ Na ₃ VO ₄
* 100 мМ NaCl
* 1% Thermo Scientific ™ Triton ™ X-100
* 1 мМ EDTA
* 10% глицерин
* 1 мМ EGTA
* 0,1% SDS
* 1 мМ NaF
* 0,5% дезоксихолат
* 20 мМ Na ₄ P ₂ O ₇

Доступен буфер для экстракции клеток — кат. нет. FNN0011.

Этот буфер для экстракции клеток можно разделить на аликвоты 1x в микроцентрифужных пробирках и хранить при –20 ° C до использования.Перед извлечением клеток разморозьте на льду.

Необходимые дополнительные реагенты:

1 мМ PMSF
коктейль ингибиторов протеазы, Sigma (каталожный номер P-2714)

Этот буфер для экстракции клеток должен быть дополнен 1 мМ PMSF (не входит в комплект) и коктейлем ингибиторов протеазы ( не входит в комплект) непосредственно перед использованием для приготовления буфера для полной экстракции клеток. Добавление коктейля ингибиторов протеазы и PMSF необходимо для ингибирования протеолиза в клеточных экстрактах. Для добавления PMSF мы рекомендуем установить значение 0.3 М маточного раствора в ДМСО и добавление объема, достаточного для конечной концентрации 1 мМ (т.е. 17 мкл на 5 мл буфера для экстракции клеток). PMSF очень нестабилен и должен быть добавлен непосредственно перед использованием, даже если был добавлен ранее. Для добавления коктейля ингибиторов протеазы мы рекомендуем Sigma (каталожный номер P-2714), восстановленный в соответствии с инструкциями производителя, и добавление 250 мкл на 5 мл буфера для экстракции клеток. Стабильность буфера для экстракции клеток с добавлением ингибитора протеазы составляет 24 часа при 4 ° C.

Обработка клеток

Этот метод можно использовать для получения относительно больших количеств клеточных экстрактов с каждым из изученных режимов стимуляции.Этапы промывки, включенные в эту процедуру, помогают минимизировать компоненты среды в экстрактах клеток.

1. Оценить плотность клеток: Клетки суспензии: Подсчитать количество клеток суспензии путем подсчета на гемацитометре. Адгезивные клетки: Оцените плотность клеток путем визуального осмотра под микроскопом. Уровни конфлюэнтности 70–80% считаются оптимальными для многих исследований передачи сигналов.


2. Стимулируйте клетки по желанию.


3. Перенесите клетки в чистые конические пробирки на 15 мл: Клетки-суспензии: Разберите аликвоты желаемого количества клеток в среде в чистые конические пробирки на 15 мл. Адгезивные клетки: Удалите клетки из сосуда соскабливанием. Перенести среду, содержащую отделившиеся клетки, в чистые конические пробирки на 15 мл.


4. Соберите клетки центрифугированием при 300 x g в течение 7 минут.


5. Аспирируйте среду.


6. Ресуспендируйте гранулы в ледяном PBS.


7. Соберите клетки центрифугированием при 300 x g в течение 7 минут при 4 ° C.


8. Выполните аспирацию PBS.


9. Лизируйте клетки, нанося пипеткой буфер для полной экстракции клеток в каждую пробирку.Мы рекомендуем использовать 1 мл буфера для полной экстракции клеток на 10 ⁸ клеток. Важно отметить, что это значение может потребовать оптимизации для каждого конкретного приложения.


10. Перенесите лизаты в чистые микроцентрифужные пробирки.


11. Смесь перемешайте на вортексе, затем инкубируйте смесь на льду в течение 30 минут, периодически встряхивая.


12. Осветите лизаты центрифугированием при 14 000 об / мин (13 000 x g) при 4 ° C в течение 10 минут.


13. Перенесите осветленные экстракты клеток в чистые микроцентрифужные пробирки.


14. Осветленные клеточные экстракты следует хранить при –80 ° C до готовности к анализу. Избегайте повторяющихся циклов замораживания-оттаивания. При подготовке к проведению анализа дайте образцам оттаять на льду. Хорошо перемешайте перед анализом.


15. Определите концентрацию белка с помощью подходящего метода, такого как набор для количественного определения белка Invitrogen ™ Quant-iT ™ (№ по каталогу Q33210). Клеточные экстракты, полученные этим методом, обычно имеют концентрацию белка от 1 до 10 мг / мл.


16. Для некоторых аналитов требуется этап обработки пробы.Пожалуйста, обратитесь к протоколу для конкретного аналита для получения подробной информации о рекомендациях по обработке образцов.


17. Все клеточные экстракты требуют разбавления по крайней мере 1:10 в стандартном буфере для разбавления перед анализом с помощью наборов Invitrogen ™.

Методы экстракции образцов для расширенного протеомного анализа растительных тканей

Протокол: быстрый, комплексный и воспроизводимый одностадийный метод экстракции для быстрого получения полярных и полуполярных метаболитов, липидов, белков, крахмала и полимеров клеточной стенки из одного образца | Заводские методы

Вестерн-блот подготовка проб | Abcam

Буферы для лизиса различаются по своей способности солюбилизировать белки, при этом буферы, содержащие додецилсульфат натрия (SDS) и другие ионные детергенты, считаются самыми жесткими и, следовательно, с наибольшей вероятностью дают самый высокий выход.

При выборе буфера для лизиса главное внимание уделяется тому, распознает ли выбранное антитело денатурированные образцы. Если это не так, это будет указано в таблице данных антител, и следует использовать буферы без детергента или с относительно мягкими неионными детергентами (NP-40, Triton X-100).

Рецепты буфера для лизиса:

Буфер NP-40

• 150 мМ хлорид натрия
• 1,0% NP-40 (Тритон X-100 может быть заменен на NP-40)
• 50 мМ Трис pH 8,0

Это популярный буфер для изучения белков, которые являются цитоплазматическими или мембраносвязанными, а также для экстрактов целых клеток.Если есть опасения, что интересующий белок не полностью экстрагируется из нерастворимого материала или агрегатов, буфер RIPA может быть более подходящим, поскольку он содержит ионные детергенты, которые легче переводят белки в раствор.

Буфер RIPA (буфер для анализа радиоиммунопреципитации)

• 150 мМ хлорид натрия
• 1,0% NP-40 или Triton X-100
• 0,5% дезоксихолат натрия *
• 0,1% SDS (додецилсульфат натрия)
мМ Трис, pH 8.0

* Может быть приготовлен как 10% основной раствор, который необходимо защищать от света.

Буфер RIPA полезен для экстрактов целых клеток и мембраносвязанных белков и может быть предпочтительнее буферов, содержащих только NP-40 или Triton X-100, для экстракции ядерных белков. Это нарушит белок-белковые взаимодействия и, следовательно, может быть проблематичным для иммунопреципитации и анализов с понижением уровня.

В случаях, когда важно сохранить белок-белковые взаимодействия или минимизировать денатурацию, следует использовать буфер без ионных детергентов (например, SDS) и в идеале без неионных детергентов (например, Triton X-100).

Лизис клеток буфером, не содержащим детергентов, достигается механическим сдвигом, часто с помощью гомогенизатора Даунса или пропусканием клеток через наконечник шприца. В этих случаях достаточно простого Трис-буфера, но, как отмечалось выше, для высвобождения белков, связанных с мембраной или цитоскелетом, требуются буферы с детергентами.

Трис-HCl буфер

Трис-Тритоновый буфер (цитоскелетные белки)

• 10 мМ Трис, pH 7,4
• 100 мМ NaCl
• 1 мМ ЭДТА
• 1 мМ ЭГТА
-100
• 10% глицерин
• 0.1% SDS
• 0,5% дезоксихолат

Все четыре из этих буферов будут храниться при 4 ° C в течение нескольких недель или до года, если их разделить на аликвоты и хранить при -20 ° C.

Как только происходит лизис, начинается протеолиз, дефосфорилирование и денатурация. Эти события можно значительно замедлить, если образцы постоянно держать на льду или при 4 ° C, а соответствующие ингибиторы добавляются свежими в буфер для лизиса.

Доступны готовые коктейли из ингибиторов от разных поставщиков, но вы можете приготовить коктейль самостоятельно.

Приготовление ортованадата натрия

Выполните все шаги в вытяжном шкафу.

1. Приготовьте 100 мМ раствор в бидистиллированной воде.
2. Установите pH на 9,0 с помощью HCl.
3. Варить до бесцветного состояния. Сведите к минимуму изменение объема из-за испарения за счет неплотного покрытия.
4. Охладите до комнатной температуры.
5. Снова установите pH на 9,0.
6. Варить до бесцветного состояния.
7. Повторяйте этот цикл, пока pH раствора не останется 9.0 после кипячения и охлаждения.
8. Довести водой до первоначального объема.
9. Хранить аликвотами при -20 ° C. Отменить, если образцы пожелтели.
   

1. Поместите чашку для культивирования клеток на лед и промойте клетки ледяным PBS.
2. Аспирируйте PBS, затем добавьте ледяной буфер для лизиса (1 мл на 10 ⁷ клеток / 100 мм чашку / 150 см ^{2 колбы} ; 0,5 мл на 5×10 ⁶ клеток / 60 мм чашку / 75 см ^{2 колбы} ).
3. Соскребите прилипшие клетки с чашки с помощью холодного пластикового скребка для клеток, затем осторожно перенесите суспензию клеток в предварительно охлажденную микроцентрифужную пробирку. В качестве альтернативы клетки можно трипсинизировать и промывать PBS перед ресуспендированием в буфере для лизиса в микроцентрифужной пробирке.
4. Поддерживайте постоянное перемешивание в течение 30 минут при 4 ° C.
5. Центрифуга в микроцентрифуге при 4 ° C. Возможно, вам придется изменить силу и время центрифугирования в зависимости от типа клеток; Ориентировочное значение — 20 минут при 12000 об / мин, но это должно быть определено для вашего эксперимента (например,грамм. лейкоциты нуждаются в очень легком центрифугировании).
6. Осторожно извлеките пробирки из центрифуги и поместите на лед, аспирируйте супернатант и поместите в свежую пробирку, хранящуюся на льду, и выбросьте осадок.

1. Рассеките интересующую ткань чистыми инструментами, предпочтительно на льду, и как можно быстрее, чтобы предотвратить разложение протеазами.
2. Поместите ткань в круглодонные микроцентрифужные пробирки или пробирки Эппендорфа и погрузите в жидкий азот, чтобы быстро заморозить.Храните образцы при -80 ° C для дальнейшего использования или на льду для немедленной гомогенизации.
3. Для кусочка ткани размером ~ 5 мг быстро добавьте в пробирку ~ 300 мкл ледяного буфера для лизиса, гомогенизируйте с помощью электрического гомогенизатора, дважды промойте лезвие еще 2 х 300 мкл буфера для лизиса, затем поддерживайте постоянное перемешивание в течение 2 дней. ч при 4 ° C (например, поместите на орбитальный шейкер в холодильник). Объемы буфера для лизиса должны определяться в зависимости от количества присутствующей ткани. Белковый экстракт не следует слишком разбавлять, чтобы избежать потери белка и больших объемов образцов, которые необходимо загрузить в гели.Минимальная рекомендуемая концентрация — 0,1 мг / мл, оптимальная — 1–5 мг / мл).
4. Центрифуга в течение 20 минут при 12000 об / мин при 4 ° C в микроцентрифуге. Осторожно извлеките пробирки из центрифуги и поместите на лед, аспирируйте супернатант и поместите в свежую пробирку, хранящуюся на льду. Выбросьте гранулы.
   

1. Выполните анализ Брэдфорда, анализ Лоури или анализ бицинхониновой кислоты (BCA). Бычий сывороточный альбумин (БСА) — часто используемый стандарт белка.
2. После того, как вы определили концентрацию каждого образца, вы можете заморозить его при -20 ° C или -80 ° C для дальнейшего использования или подготовки к иммунопреципитации или для нанесения на гель.
   

Денатурированные, восстановленные образцы

Антитела обычно распознают небольшую часть интересующего белка (называемого эпитопом), и этот домен может находиться в трехмерной конформации белка.Чтобы обеспечить доступ антитела к этой части, необходимо развернуть белок, т.е. денатурировать его.

Для денатурирования используйте загрузочный буфер с анионным детергентом додецилсульфатом натрия (SDS) и кипятите смесь при 95–100 ° C в течение 5 минут. Нагревание при 70 ° C в течение 5–10 мин также допустимо и может быть предпочтительным при изучении многопроходных мембранных белков. Они имеют тенденцию к агрегированию при кипячении, и агрегаты могут не входить в гель эффективно.

Стандартный буфер загрузки называется 2X буфером Лэммли (Laemmli UK, 1970.Расщепление структурных белков при сборке головки батериофага Т4. Природа, 227, 680–5). Он также может быть изготовлен с концентрацией 4X и 6X, чтобы минимизировать разбавление образцов. 2X следует смешать с образцом в соотношении 1: 1.

Рецепт 2x буфера Лэммли

• 4% SDS
• 10% 2-меркаптоэтанол
• 20% глицерин
• 0,004% бромфеноловый синий
• 0,125 M Трис HCl
• Проверьте pH pH 6,8

Когда SDS используется с белками, все белки становятся отрицательно заряженными из-за их присоединения к анионам SDS.SDS связывается с белками довольно специфично в массовом соотношении 1,4: 1. При этом SDS наделяет полипептид отрицательным зарядом пропорционально его длине. Денатурированные полипептиды становятся стержнями отрицательного заряда с равными плотностями заряда на единицу длины. Следовательно, миграция определяется молекулярной массой, а не внутренним зарядом полипептида.

Степень SDS важна для качественного разделения белков: окрашенный белком фон вдоль отдельных участков геля с нечеткими или слегка различимыми полосами белка указывает на старый или некачественный SDS.Включение в буфер 2-меркаптоэтанола или дитиотреитола снижает дисульфидные мостики, что необходимо для разделения по размеру.

Глицерин добавляется в буфер для загрузки, чтобы увеличить плотность загружаемого образца и, следовательно, удерживать образец на дне лунки, ограничивая переполнение и неравномерную загрузку геля.

Для визуализации миграции белков обычно включают в загрузочный буфер небольшую молекулу анионного красителя (например, бромфенолового синего). Поскольку краситель является анионным и небольшим, он будет мигрировать быстрее всех компонентов смеси, подлежащей разделению, и обеспечивает фронт миграции для отслеживания процесса разделения.

Во время обработки образца белка образец следует перемешать встряхиванием до и после стадии нагревания для лучшего разрешения.

Нативные и невосстановленные образцы

Альтернативно, антитело может распознавать эпитоп, состоящий из несмежных аминокислот. Хотя аминокислоты эпитопа отделены друг от друга в первичной последовательности, они близки друг к другу в сложенной трехмерной структуре белка, и антитело будет распознавать эпитоп только в том виде, в каком он существует на поверхности складчатая конструкция.

В этих обстоятельствах важно проводить вестерн-блоттинг в неденатурирующих условиях, и это будет указано в таблице данных в разделе приложений. В общем, неденатурирующие условия просто означают исключение SDS из буферов для образцов и миграции и без нагревания образцов.

Некоторые антитела распознают белок только в его невосстановленной форме (особенно по остаткам цистеина), и восстанавливающие агенты β-меркаптоэтанол и DTT должны быть исключены из загрузочного буфера и буфера для миграции.

Практическое правило: уменьшайте и денатурируйте, если не указано иное.

Abcam предоставляет протоколы «AS-IS» на основе экспериментов в лабораториях Abcam с использованием реагентов и продуктов Abcam; ваши результаты при использовании протоколов за пределами этих условий могут отличаться. выбранный метод для глубокого и всестороннего анализа протеомов и стал ключевой технологией для поддержки прогресса в науках о жизни и биомедицине.Однако подготовка образцов в протеомике не стандартизирована и способствует недостаточной воспроизводимости. Основная задача состоит в том, чтобы извлечь все белки таким образом, чтобы обеспечить эффективное расщепление до пептидов и совместимость с последующим масс-спектрометрическим анализом. Современные методы основаны на идее удаления детергентов или хаотропных агентов во время обработки образцов, которые необходимы для экстракции белка, но мешают пищеварению и ЖХ-МС. Эти многоэтапные приготовления подвержены потерям, искажениям и загрязнениям, при этом они требуют времени и трудозатрат.

Мы сообщаем об универсальном методе без использования моющих средств под названием Подготовка образцов путем простой экстракции и разложения (SPEED) , который основан на простой трехэтапной процедуре: подкислении, нейтрализации и разложении. SPEED — это однореакторный метод получения пептидов из различных источников, который легко применим даже для устойчивых к лизису типов образцов, поскольку чистая трифторуксусная кислота (TFA) используется для высокоэффективной экстракции белка. Обработка образцов на основе SPEED отличается высокой воспроизводимостью, обеспечивает исключительный выход пептидов и позволяет готовить даже образцы тканей с временем работы менее 15 минут и без какого-либо специального оборудования.Оценка производительности SPEED показала, что количество определяемых количественно белков и количественная воспроизводимость превосходят хорошо зарекомендовавшие себя протоколы обработки образцов FASP, ISD-Urea и SP3 для различных типов образцов, включая человеческие клетки, бактерии и ткани, даже при низких значениях. исходные количества белка.

ВВЕДЕНИЕ

Белки регулируют и катализируют все клеточные процессы. Следовательно, анализ структуры белков имеет первостепенное значение для молекулярного понимания жизни.За последние годы технический прогресс в области масс-спектрометрии (МС) и биоинформатики позволил проводить глубокие и воспроизводимые протеомные исследования с увеличенной пропускной способностью ¹ . Большинство этих исследований в настоящее время выполняется с использованием восходящего подхода, который основан на расщеплении белков на более мелкие пептиды ² . Были разработаны различные методы подготовки образцов, направленные на обеспечение всестороннего и воспроизводимого получения пептидов из протеомов, экстрагированных из большого разнообразия типов образцов.В текущих протоколах используются моющие средства, например додецилсульфат натрия (SDS) или хаотропные агенты, такие как мочевина, для экстракции белка и поддержки лизиса образцов с помощью методов физического разрушения, таких как нагревание, ультразвуковая обработка или измельчение ^3–5 . Поскольку многие экстракционные реагенты ингибируют ферментативное расщепление белков и несовместимы с ЖХ-МС / МС, идея большинства методов подготовки проб состоит в том, чтобы удалить мешающие вещества перед перевариванием либо путем фильтрации (FASP) ⁶ , либо осаждения (переваривание на осадке , STrap) ^7,8 или очистка на основе гранул (SP3) ⁹ .Однако усиление лизиса с помощью методов физического разрушения и последующей очистки белка требует дополнительных этапов обработки образцов, которые связаны с сопутствующими потерями, смещениями и возможными загрязнениями, но при этом требуют времени и трудозатрат.

Основным исключением является хорошо известное и часто используемое переваривание белков в растворе (ISD), которое чаще всего основано на экстракции белков при высоких концентрациях мочевины и последующем разбавлении до диапазона концентраций, который не препятствует расщеплению трипсином. больше ¹⁰ .Преимущества ISD на основе мочевины (ISD-Urea) в значительной степени заключаются в уменьшении количества отдельных этапов, необходимых для подготовки образца, и известны своей надежностью, высокой воспроизводимостью и простотой выполнения. Однако ISD-мочевина не является универсальным методом восходящей протеомики, поскольку мочевина, в отличие от сильных детергентов, таких как SDS, неэффективна для извлечения белков из трудно поддающихся лизису образцов, таких как ткани или грамположительные бактерии. Кроме того, известно, что мочевина присоединяет к белкам искусственные модификации, известные как карбамилирование ¹¹ .Это предотвращает лизирование образцов при повышенных температурах, что было бы полезно для экстракции протеома, особенно из сложных образцов. Ограничения переваривания в растворе возникают из-за компромисса между эффективным лизисом и низким влиянием на ферментативную активность, главным образом, трипсина.

В этом исследовании представлена ​​разработка метода пробоподготовки, который преодолевает ограничения в лизисе и экстракции ISD, но сохраняет его прямолинейный подход. Новый метод, получивший название «Подготовка образца путем легкой экстракции и разложения» (SPEED) , состоит из трех простых этапов, а именно подкисления, нейтрализации и разложения.SPEED не использует ни детергентов, ни хаотропных агентов для экстракции белка и является быстрым, дешевым, надежным, хорошо воспроизводимым, хорошо подходит для различных типов образцов и прост в выполнении даже для неспециалистов. Сравнение SPEED с FASP, SP3 и ISD-Urea для безметочного количественного анализа эукариотических клеток и тканей, а также различных видов бактерий показывает его универсальную применимость и превосходные характеристики, особенно в отношении количества определяемых количественно белков и количественной воспроизводимости в широком диапазоне типов образцов.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Разработка SPEED

Всесторонний, точный и глубокий протеомный анализ основан на воспроизводимой генерации пептидов из белков данного типа образца. Основная задача при подготовке образца — извлечь все белки таким образом, чтобы обеспечить эффективное расщепление до пептидов и совместимость с последующим масс-спектрометрическим анализом. Универсальный восходящий метод подготовки образцов протеомики в идеале должен состоять из одной стадии экстракции, которая не зависит от типа образца, и позволяет осуществлять последующее протеолитическое расщепление без необходимости очистки белка.Чтобы разработать такой одноэтапный универсальный метод экстракции белка, мы решили оставить следы обычной химии буфера для лизиса и в конечном итоге использовали чистую трифторуксусную кислоту (TFA).

TFA — сильная кислота (pK _a = 0,2) и отличный растворитель для белков ¹² . Мы обнаружили, что чистый TFA способен растворять клетки и ткани в течение нескольких минут при комнатной температуре с образованием прозрачных лизатов. Вязкость лизатов низкая, так как ДНК быстро разрушается после подкисления.Анализ клеток E.coli , инкубированных с TFA в течение разного времени от 1 до 60 минут, показал, что TFA не гидролизует пептидные связи и не модифицирует аминокислотные остатки (рис. 1). Интенсивность белка в образцах с разным временем инкубации с TFA имела превосходные коэффициенты Пирсона, составляющие по меньшей мере 0,994, и количество идентификаций белков и пептидов не было затронуто (рис. 1).

Влияние времени инкубации TFA в диапазоне от 1 до 60 минут на производительность E.coli протеомный анализ. Количество идентифицируемых пептидов и белков, а также пептидов с рваным N и общее количество совпадений пептидного спектра (PSM) всех зависимых пептидов показано в а). Ни на один из этих параметров инкубация TFA не влияла во времени. Постоянное количество пептидов с рваным N доказывает, что кислотный гидролиз пептидных связей не происходил. Пропорции различных зависимых модификаций пептидов относительно общего количества зависимых PSM были нанесены на график в b), показывая, что типы модификаций пептидов также остались неизменными.Белки были количественно определены с использованием алгоритма LFQ в MaxQuant, а коэффициенты корреляции Пирсона для всех комбинаций образцов показаны в c). Сравнение интенсивностей LFQ для 1 и 60 мин инкубации TFA перед нейтрализацией образца дополнительно визуализируется на диаграмме разброса (d) с цветовой кодировкой распределения плотности белка. Время инкубации TFA не повлияло на количественную воспроизводимость, поскольку корреляция интенсивностей белка была превосходной, в результате чего коэффициенты Пирсона были равны по крайней мере 0.994.

Лизаты TFA получают для протеолитического расщепления путем нейтрализации слабым основанием, pK _a которого соответствует оптимальному диапазону pH выбранной протеазы. В такой буферной системе с высокой емкостью желаемое значение pH стабильно в широком диапазоне объемных соотношений между TFA и основанием (рис. S1). TrisBase (pK _a = 8,1) был выбран для нейтрализации лизатов TFA для триптического расщепления. После нейтрализации лизаты становятся слегка мутными, поскольку белки осаждаются и образуют мелкие частицы, но не склонны к агрегированию.Поскольку нейтрализация экзотермична, образцы мгновенно нагреваются до 70–80 ° C. Это тепло можно использовать для сокращения времени инкубации, необходимого для восстановления и алкилирования дисульфидных связей после мгновенного добавления TCEP и CAA до 3-5 минут.

TrisBase был выбран для нейтрализации TFA для обработки образцов на основе SPEED. Значение pH смесей TFA / TrisBase стабильно при pK _a = 8,1 TrisBase в широком диапазоне объемных соотношений и, следовательно, хорошо подходит для триптического расщепления белков.

Белки в таких дисперсиях легко доступны для трипсина и могут эффективно перевариваться. Однако оптимальные результаты были получены после разбавления дисперсии водой в 3-10 раз для уменьшения молярности солей и плотности образцов (данные не показаны). Было обнаружено, что триптическое расщепление в дисперсии происходит аналогично перевариванию в растворе. Оптимальное соотношение фермента к белку находится в пределах от 1:20 до 1: 100 в зависимости от концентрации белка, и для получения ожидаемых выходов пептидов необходимо 4-20 часов инкубации при 37 ° C.

Результирующий протокол для образца «Подготовка образцов с помощью простой экстракции и разложения» (SPEED) состоит из трех этапов, а именно подкисления, нейтрализации и разложения. Выполнение SPEED проиллюстрировано для клеток Escherichia coli и Staphylococcus aureus , а также для ткани печени мыши на рис. 2. TFA растворяет E. coli и ткань печени мыши полностью в течение 1 и 10 минут соответственно, при подкислении. грамположительных бактерий S.aureus образует мутный лизат, возможно, из-за нерастворимых компонентов клеточной стенки (рис. 2b). Поэтому приготовление грамположительных бактерий требует короткого микроволнового облучения в течение 10 секунд для эффективного пищеварения. Кроме того, TFA не растворяет полностью крупные коллагеновые волокна, например из препаратов для кожи, как и буферы для лизиса на основе детергентов. Обычно такое поведение желательно, поскольку в противном случае изобилие нескольких белков клетчатки намного превышало бы другие белки и, таким образом, препятствовало бы всестороннему анализу протеомов тканей.Однако, если его преследовать, растворение коллагеновых структур также может поддерживаться коротким микроволновым облучением.

Обработка образца с помощью SPEED состоит из трех отдельных этапов, а именно подкисления чистой трифторуксусной кислотой (TFA) (1), нейтрализации 2M TrisBase (2) и разложения ( 3). Панели a-c) иллюстрируют шаги 1-2 процедуры для трех различных типов образцов. Пока TFA растворяет E.coli и ткань печени мыши при комнатной температуре полностью за несколько минут, лизис грамположительных бактерий S. aureus требует дополнительного этапа микроволнового облучения в течение 10 секунд (b). После нейтрализации образцы становятся немного мутными (c) из-за выпадения белков в осадок. Белки количественно определяют в полученных дисперсиях путем измерения мутности при 360 нм и затем переваривают путем добавления трипсина.

После нейтрализации (рис. 2в) образцы мутнеют из-за выпадения белков в осадок.Белки в этих дисперсиях стабильны при длительном хранении при -20 ° C или -80 ° C. Для определения содержания белка обычными методами белки необходимо солюбилизировать, что достигается добавлением SDS к аликвоте образца перед проведением анализа по выбору, например измерения флуоресценции триптофана ¹³ . Однако наиболее простой подход к количественному определению белков в дисперсиях — это измерение мутности, которая является абсолютной мерой содержания белка без необходимости каких-либо манипуляций с образцом и времени инкубации.Мы обнаружили, что измерения мутности при 360 нм давали согласованные результаты для разных типов образцов. Данные на рисунке S2 предполагают линейный ответ для концентраций белка от 0,05 до 1 мкг / мкл (1 AU = 0,79 мкг / мкл). Белковые дисперсии далее подвергаются расщеплению после 3-5-кратного разбавления водой без необходимости каких-либо стадий очистки, независимо от типа образца. Прогресс переваривания можно отслеживать в режиме реального времени с помощью непрерывных измерений мутности в закаленном ридере для микропланшетов по мере того, как пептиды становятся растворимыми (рис.S3).

Мутность различных типов образцов, приготовленных с помощью SPEED, измеряли при 360 нм в диапазоне концентраций 0,05–1 мкг / мкл. Измерение флуоресценции триптофана использовали в качестве эталонного метода для определения содержания белка. Мутность не зависела от типа образца и линейно коррелировала с концентрацией белка (1 АЕ = 0,79 мкг / мкл).

SPEED-подготовленный E.coli (20 мкг) переваривали при различных соотношениях белок / фермент (мас. / мас.). Мутность измеряли в режиме реального времени при длине волны 360 нм с использованием микропланшетного ридера, нагретого до 37 ° C. Прогресс переваривания триптического белка коррелирует с уменьшением мутности по мере того, как образовавшиеся пептиды становятся водорастворимыми.

Сравнение SPEED с FASP, SP3 и Urea-ISD для анализа различных типов образцов

Эффективность SPEED была оценена для анализа различных типов образцов по сравнению с методами на основе моющих средств (FASP, SP3) ^{6, 9} , а также для разложения раствора на основе мочевины ¹⁰ .Отбор образцов состоял из легко лизируемого образца средней сложности ( клеток E.coli, ) при различных начальных количествах (1 и 20 мкг белка), легко лизируемого образца высокой сложности (клетки HeLa), трудно поддающийся лизису образец высокой сложности (ткань легкого мыши) и высоколизирующий образец средней сложности ( клеток B. cereus ). Все образцы готовили в трех экземплярах, и равные количества пептидов каждого препарата анализировали с помощью однократных измерений ЖХ-МС.Результаты SPEED, FASP, SP3 и ISD-Urea сравнивали путем извлечения 10 параметров, зависящих от подготовки образца, из данных, которые были разделены на разделы: идентификация, количественная оценка, переваривание и модификация. Результаты были нормализованы относительно ценности лучшего соответствующего метода и визуализированы на тепловой карте, чтобы дать общий обзор производительности методов (рис. 3).

Подготовка образца SP3, FASP, SPEED и расщепление в растворе на основе мочевины (ISD-Urea) сравнивали с помощью трех анализов на основе LFQ E.coli с использованием 20 или 1 мкг исходного материала, клеток B. cereus и HeLa, а также легочной ткани мыши. Результаты различных параметров, отсортированных в соответствии с идентификацией секций, количественной оценкой, усвоением и модификациями, отображаются на тепловой карте (а). Наилучший результат для каждого параметра установлен на 100% (темно-зеленый), а относительные различия между методами подготовки образцов обозначены цветом в соответствии с легендой. Красное и зеленое окружение диапазона, охватываемого каждым параметром, показывают, считаются ли большие или маленькие числа желательными.Поскольку клетки B. cereus не могут быть получены с помощью SP3, соответствующие разделы на тепловой карте отображаются белым цветом. Время инкубации и индивидуальное количество этапов обработки образцов, исключая расщепление и обессоливание, сравниваются в (b).

Идентификация

Протокол SPEED позволил идентифицировать большинство белков в легочной ткани мыши (+3% по сравнению с FASP), HeLa (+3% по сравнению с ISD-Urea) и B. cereus (+9% по сравнению с FASP). ) клеток, в то время как ISD-Мочевина идентифицировала большинство белков в обоих анализах легко лизируемого E.coli , превышая СКОРОСТЬ на 3% (20 мкг исходного материала) или 1% (1 мкг исходного материала) соответственно. Зависимость от типа образца протокола ISD-Мочевина для эффективного извлечения белков проиллюстрирована тем, что это метод с наименьшим количеством идентификаций белка в обоих типах образцов, которые более трудно лизировать, а именно в легочной ткани мыши и в B. cereus . Что касается идентификации белков, FASP и SP3 отставали от SPEED для всех проанализированных типов образцов. Кроме того, нам не удалось подготовить B.cereus для анализа ЖХ-МС с использованием SP3, предположительно потому, что клеточная стенка мешает генерации пептидов. Мы наблюдали ту же проблему для других грамположительных бактерий ранее, что, следовательно, кажется неотъемлемым ограничением исходного протокола SP3.

Анализ низких количеств белка обычно означает, что экстракты белка сильно разбавлены, что может повлиять на эффективность обработки образцов ⁴ . Выходы пептидов сравнивали с препаратами осадка клеток E. coli , соответствующих исходным количествам белка 1 мкг.Клетки лизировали в 10 мкл соответствующего буфера и обрабатывали FASP, SP3, SPEED и ISD-Urea. Выход пептидов определяли как интенсивность пептида по отношению к его среднему значению по всем измерениям с инъекцией 1 мкг пептидов (20 мкг исходного материала), как рассчитано с помощью MaxQuant. Средний выход пептидов составил 55% для SPEED, 44% для ISD-Urea, 37% для FASP и 29% для SP3. Большинство белков было идентифицировано с использованием ISD-Мочевины, при этом SPEED (-1%) немного отставал, а FASP (-5%), а также SP3 (-5%) отставали немного дальше.

Количественная оценка

Воспроизводимые измерения интенсивности белков необходимы для количественного протеомного анализа, поскольку низкие вариации повышают статистическую мощность однозначного обнаружения небольших различий в экспрессии. В то время как интенсивности белка хорошо коррелировали для всех методов подготовки образцов с коэффициентами Пирсона, превышающими 0,98 для всех типов образцов, коэффициенты вариации (CV) варьировались. Образцы SPEED показали самые низкие вариации интенсивности белка со средним CV <9% для всех типов образцов.ISD-Мочевина имела аналогичную воспроизводимость по сравнению с SPEED в обоих анализах клеток E. coli , но опять же страдала от его ограниченной эффективности лизиса, что приводило к увеличению CV для анализа более трудно поддающихся лизису типов образцов, легочной ткани мыши ( медиана CV = 16%) (рис. S4 ab) и B. cereus (медиана CV = 12%). Анализ генной онтологии белков с разной интенсивностью в ткани легких мышей показал, что мембранные белки менее эффективно подготавливаются для ЖХ-МС при сочетании мочевинного буфера и ультразвуковой обработки по сравнению с SPEED, FASP и SP3 (рис.S4 e). Поскольку подготовка образцов с использованием FASP и SP3 привела к увеличению CV по сравнению с SPEED для всех типов образцов и по сравнению с ISD-Urea для всех типов легко анализируемых образцов, воспроизводимость количественного определения белка, по-видимому, выигрывает от небольшого количества этапов обработки образцов (рис. . 3b). В соответствии с этим наблюдением SPEED привел к наибольшему количеству белков, количественно определенному без пропущенных значений для всех типов образцов, за исключением E.coli (исходное количество 20 мкг), где ISD-Мочевина превышала SPEED на 1%.

Ткань легкого мыши получали в трех повторах с использованием SP3, FASP, SPEED и ISD-Urea. Количество белков определяли по данным ЖХ-МС / МС с использованием алгоритма LFQ в MaxQuant. Коэффициенты вариации (CV) нанесены на график в зависимости от их соответствующих интенсивностей для белков (а) и пептидов (b) с цветовой кодировкой распределения плотности. Количественное определение белка (c) и идентификация (d) различных методов подготовки образцов сравниваются на диаграммах Венна.Честно значимое различие среднего значения Тьюки (THSD) белков с онтологиями клеточных компонентов, связанных с мембранами, сравнивается на тепловой карте (e)

Переваривание

Триптическое расщепление белков является фундаментальным шагом для подготовки образцов протеомики снизу вверх. Эффективность протеолиза зависит от источника трипсина, соотношения белка и фермента, температуры и времени инкубации, которые в этом исследовании поддерживались постоянными независимо от метода подготовки образца, а также от концентрации белка и состава буфера, которые были переменными ^14,15 .Наименьшее количество пептидов с пропущенными сайтами расщепления было обнаружено в образцах, приготовленных SP3, во всех экспериментах (12-22%). Предположительно этот результат является результатом низкого объема переваривания по сравнению с FASP, SPEED и ISD-Urea. Однако более высокая эффективность переваривания не обязательно связана с более низкой вариабельностью количественного определения белка ¹⁶ . Препараты с использованием SPEED приводили к увеличению доли пептидов с пропущенными сайтами расщепления на 2-6%, но превосходили SP3 с точки зрения CV белков во всех экспериментах.Если потребуется полный протеолиз, количество пропущенных сайтов расщепления с помощью SPEED может быть уменьшено путем увеличения концентрации белка или соотношения трипсин-белок, а также путем добавления LysC во время переваривания. Количество пептидов ragged-N в препаратах SPEED было наименьшим или, по крайней мере, 2 ^и наименьшим (+0,07% относительно общего числа ID пептидов) во всех препаратах. Опять же, это подчеркивает, что пептиды не гидролизуются при подкислении с использованием чистой TFA.

Модификация

Белки идентифицируются по масс-спектрам путем поиска в базе данных, при этом обычно карбамидометилирование цистеинов и окисление метионина рассматриваются как возможные модификации пептидов.FASP, ISD-Мочевина и SP3 используют дитиотреитол (DTT) для восстановления и йодацетамид (IAA) для последовательного алкилирования дисульфидных связей, в то время как SPEED использует трис (2-карбоксиэтил) фосфин (TCEP) и хлорацетамид (CAA) одновременно. Одновременное использование TCEP и CAA при повышенных температурах значительно сокращает время обработки образца, однако было обнаружено, что CAA коррелирует с увеличением числа окислений метионина, хотя возможный механизм не был предложен ¹⁷ . Для сравнения методов количество наблюдаемых модификаций было нормализовано относительно количества идентифицированных пептидов в том же образце (таблица S2).Наибольшая доля цистеинсодержащих пептидов была обнаружена в образцах, приготовленных с мочевиной-ISD, за исключением B. cereus , однако за счет повышенного чрезмерного алкилирования, приводящего к модификации нежелательных аминокислотных остатков (фиг. S4). SPEED идентифицировал на ~ 10% меньше карбамидометилированных цистеинов из HeLa, E. coli и ткани легкого мыши по сравнению с мочевиной-ISD, но чрезмерное алкилирование наблюдалось в 4-5 раз реже. Окисление метионина в целом было обнаружено на низких уровнях (максимум во всех образцах = 24.6%) и, как было установлено, не зависит от реагентов алкилирования (Таблица S2). Различия между разными типами образцов были больше, чем между разными препаратами одного и того же образца, и не было обнаружено, что какой-либо метод приводит к повышенным уровням окисления метионина в целом. Это говорит о том, что на окисление влияют неизвестные факторы. Следовательно, по крайней мере, когда реагенты восстановления и алкилирования солюбилизируются непосредственно перед использованием, использование TCEP и CAA не имело нежелательных побочных эффектов по сравнению с DTT и IAA.

Другие часто наблюдаемые модификации протеомики, связанные с подготовкой образцов дезамидирование, карбамилирование, потеря аммиака и окисление остатков, за исключением метионина ¹⁸ . Результаты зависимого поиска пептидов показали, что наименьшее общее количество этих непреднамеренно введенных модификаций наблюдалось для SP3 и наибольшее общее количество для ISD-мочевины во всех типах образцов (рис.S5). SPEED и FASP были в паре при введении на 1-2% больше искусственных модификаций по сравнению с общим количеством идентифицированных пептидов по сравнению с SP3. Открытый поисковый анализ данных по легочной ткани мышей с использованием MSFragger ¹⁹ также показал, что SPEED не добавляет никаких неаннотированных модификаций к пептидам (данные не показаны).

. Идентификации зависимых пептидов модификаций, которые, как известно, вносятся во время подготовки образца, отображаются относительно общего числа идентификаций пептидов для каждого анализируемого образца.Доли отдельных видов модификации обозначены цветом.

ОБСУЖДЕНИЕ

Всесторонний, точный и глубокий протеомный анализ основан на воспроизводимой генерации пептидов из белков данного типа образца. SPEED предлагает некоторые преимущества по сравнению с обычными методами для этой цели. Это минимальная стратегия подготовки проб для универсальной протеомики, основанная на принципиально другом химическом составе по сравнению с существующими методами. SPEED сочетает в себе простоту переваривания в растворе с высокоэффективной одностадийной экстракцией даже мембранных белков из образцов тканей или устойчивых к лизису грамположительных бактерий.Экстракция TFA позволяет избежать использования детергентов и хаотропных агентов, а также методов физического разрушения для лизиса и экстракции белка. Это позволяет обрабатывать образцы по-настоящему в одном сосуде, включая экстракцию белка путем простого подкисления. Протокол подготовки образцов SPEED позволяет получать прозрачные растворы пептидов даже из образцов тканей без удаления какого-либо материала образца и, следовательно, без потерь белка. Анализ лизатов E. coli с длительным временем инкубации с TFA до 1 часа при комнатной температуре показал, что TFA не гидролизует и не модифицирует первичные структуры белка.Кроме того, известно, что подкисление TFA надежно инактивирует патогенные микроорганизмы, включая бактериальные эндоспоры из Bacillus anthracis , и поэтому хорошо подходит для обработки образцов инфекционных образцов, включая высокопатогенные агенты ²⁰ . Быстрая обработка, высокая производительность и широкая применимость протокола SPEED достигаются исключительно за счет разумного использования химикатов и не требует специального оборудования или даже центрифуг. Это недорогой метод, стоимость которого составляет ~ 1 евро за образец, включая наконечники для пипеток и микроцентрифужные пробирки.Кроме того, протокол может быть легко выполнен неспециалистами и сокращает время обработки до 15 минут, включая лизис и количественный анализ белка. Содержание белка в лизатах SPEED определяется измерением мутности, которое не требует каких-либо манипуляций с образцом и, следовательно, обеспечивает полное извлечение белков. Кроме того, измерения мутности позволяют в реальном времени контролировать процесс разложения, что может использоваться в качестве критерия качества перед измерениями ЖХ-МС. Благодаря своим неотъемлемым преимуществам SPEED имеет потенциал для широкого применения в протеомном сообществе как быстрый, недорогой, не содержащий детергентов и универсальный метод подготовки образцов.В будущем SPEED-обработка может быть перенесена на станции обработки жидкостей, начиная с лизиса ровной ткани путем простого пипетирования и заканчивая онлайн-мониторингом процесса пищеварения с использованием измерений мутности.

SPEED не только универсален, но и превосходит широко используемые методы FASP, SP3 и ISD-Urea для количественного протеомного анализа различных типов образцов. SPEED превзошел FASP и SP3, учитывая количество идентифицированных белков для всех проанализированных образцов и ISD-Urea для HeLa, B.cereus и легочная ткань мыши соответственно. Кроме того, было обнаружено, что SPEED и ISD-Мочевина обеспечивают повышенный выход пептидов из 1 мкг препаратов разбавленного лизата E. coli (0,1 мкг / мкл), что приводит к увеличению числа идентификаций белков. Мы пришли к выводу, что повышенный выход пептидов SPEED и ISD-Urea является результатом меньшего количества этапов обработки по сравнению с FASP и SP3, которые требуют удаления детергентов перед перевариванием и, следовательно, склонны к потере белка при низких начальных количествах.Воспроизводимость количественного определения белка также улучшилась благодаря небольшому количеству этапов обработки образцов, поскольку подготовка образцов с использованием FASP и SP3 привела к увеличению CV по сравнению со SPEED для всех типов образцов и по сравнению с ISD-Urea для всех типов легко анализируемых образцов. Подготовка образцов с использованием SPEED привела не только к лучшей количественной воспроизводимости, но и к наибольшему количеству белков, количественно определенному без пропущенных значений для всех типов образцов, кроме E. coli (исходное количество 20 мкг), где ISD-Urea превышала SPEED на 1 %.Однако высокая эффективность ISD-Мочевины для легко лизируемых клеток E. coli была компенсирована результатами анализа легочной ткани мыши и B. cereus . Мембранные белки менее эффективно экстрагировались в ткань легких при сочетании мочевинного буфера и ультразвуковой обработки по сравнению с методами на основе детергентов FASP и SP3, а также с SPEED. Обработка ISD-мочевиной также не подходила для эффективного лизиса высокорезистентных клеток B. cereus , что уменьшало количество идентификаций белка на 30% и идентификации пептидов на 64% по сравнению с SPEED.

Сравнительный анализ протоколов подготовки образцов на основе детергента (FASP, SP3), на основе хаотропных агентов (ISD-Мочевина) и на кислотной основе (SPEED) для количественного протеомного анализа различных типов образцов ясно демонстрирует преимущества малого количества этапов обработки образцов для улучшения количественной воспроизводимости, количества определяемых количественно белков и выхода пептидов из низких исходных количеств. SPEED сочетает в себе простоту разложения в растворе с высокоэффективной одностадийной экстракцией путем подкисления.Таким образом, для этого протокола требуется наименьшее количество этапов обработки проб и наименьшее время работы. Было обнаружено, что SPEED является наиболее подходящим протоколом, протестированным для количественного определения наибольшего количества белков с высочайшей точностью для широкого выбора типов образцов, и поэтому может рассматриваться как универсальный метод подготовки образцов для восходящей протеомики.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРОЦЕДУРЫ

Материалы образцов

Триптико-соевый агар (TSA) ReadyPlates ^TM (Merck, Дармштадт, Германия) инокулировали E.coli K-12 (DSM 3871), S. aureus (DSM 4910) или B. cereus (ATCC ^® 10987) и инкубировали при 37 ° C в течение ночи. Клетки собирали с помощью инокуляционной петли и промывали 2 х 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) в течение 5 минут при 4000 х g и 4 ° C. Клетки разделяли на аликвоты, снова осаждали и хранили при -80 ° C до лизиса.

Клетки HeLa (ATCC ^® CCL-2 ™) культивировали в среде DMEM с добавлением 10% FCS и 2 мМ L-глутамина при 37 ° C и собирали соскабливанием при 90% конфлюентности.Клетки промывали 2 х 2 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) в течение 8 мин при 400 x g и 4 ° C, делили аликвоты, снова осаждали и хранили при -80 ° C до лизиса.

Легкое и печень мыши BALB / c были получены из центральной лаборатории для лабораторных животных (MF3, Институт Роберта Коха, Берлин, Германия), промыты 3 раза путем погружения в 10 мл ледяного PBS, разрезаны на ломтики, разделены на аликвоты, мигают замораживали жидким азотом и хранили при -80 ° C до лизиса. После добавления буфера для лизиса (FASP, SP3, Urea-ISD) образцы легких мышей переносили в пробирки Lysing Matrix D (MP Biomedicals, Санта-Ана, Калифорния, США) и подвергали измельчению.

Подготовка образцов путем простой экстракции и разложения (SPEED)

Образцы ресуспендировали в трифторуксусной кислоте (TFA) (Uvasol ^® для спектроскопии, Merck, Дармштадт, Германия) (образец / TFA 1: 4 (об. / Об.) Или 10 мкл для эксперимента с E.coli 1 мкг) и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ( E.coli, B. cereus , HeLa) или 10 (ткань легкого мыши) мин. Образцы B. cereus дополнительно облучали в течение 10 с при мощности 800 Вт с использованием микроволновой печи. Образцы нейтрализовали 2M TrisBase с использованием 10-кратного объема TFA и дополнительно инкубировали при 95 ° C в течение 5 минут после добавления трис (2-карбоксиэтил) фосфина (TCEP) до конечной концентрации 10 мМ и 2-хлорацетамида (CAA) в конечная концентрация 40 мМ.Концентрации белка определяли путем измерения мутности при 360 нм (1 AU = 0,79 мкг / мкл) с использованием спектрофотометра GENESYS ™ 10S UV-Vis (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) и доводили до 0,25 мкг / мкл с использованием 10: 1 (об. / об.) смесь 2M TrisBase и TFA, а затем разбавили 1: 5 водой. Расщепление проводили в течение 20 ч при 37 ° C с использованием трипсина Gold, Mass Spectrometry Grade (Promega, Fitchburg, WI, USA) при соотношении белок / фермент 50: 1.

Подготовка образцов с помощью фильтра (FASP)

Образцы суспендировали в 4% SDS, 100 мМ Трис / HCl, 100 мМ DTT, pH 7.6 (образец / буфер 1:10 (об. / Об.) Или 10 мкл для эксперимента E.coli 1 мкг), инкубировали при 95 ° C в течение 5 минут и дополнительно обрабатывали ультразвуком в течение 10 ( E.coli , HeLa) или 15 ( B. cereus , ткань легкого мыши) циклов по 30 с при высоком уровне интенсивности и 4 ° C с использованием Bioruptor ^® Plus (Diagenode, Льеж, Бельгия). Образцы осветляли центрифугированием при 16000 x g в течение 5 минут и обрабатывали с использованием центробежных фильтров Microcon-30 кДа (Merck, Дармштадт, Германия) в соответствии с протоколом подготовки образцов с помощью фильтрации (FASP) Wisniewski et al. ⁶ с белками, расщепляемыми в течение 20 ч при 37 ° C с использованием трипсина Gold, Mass Spectrometry Grade (Promega, Fitchburg, WI, USA) при соотношении белок / фермент 50: 1.

Приготовление образца с твердофазным усилением в одном горшке (SP3)

Образцы суспендировали в 1% SDS, 1X коктейле с полным ингибитором протеазы (Roche, Базель, Швейцария), 50 мМ буфера HEPES, pH 8,5 (образец / буфер 1 : 10 (об. / Об.) Или 10 мкл для эксперимента E.coli 1 мкг), инкубировали при 95 ° C в течение 5 минут и затем обрабатывали ультразвуком в течение 10 ( E.coli , HeLa) или 15 ( B. cereus , ткань легкого мыши) циклов по 30 с при высоком уровне интенсивности и 4 ° C с использованием Bioruptor ^® Plus (Diagenode, Льеж, Бельгия). Далее образцы обрабатывали в соответствии с методом твердофазной улучшенной подготовки образцов в одной емкости (SP3) Hughes et al. ⁹ , за исключением того, что белки были связаны с парамагнитными гранулами при 70% ACN без подкисления, как предписано Sielaff et al. ⁴ . Расщепление проводили в течение 20 ч при 37 ° C с использованием трипсина Gold, Mass Spectrometry Grade (Promega, Fitchburg, WI, USA) при соотношении белок / фермент 50: 1.

Расщепление в растворе на основе мочевины (Urea-ISD)

Образцы суспендировали в 8 М мочевине, 50 мМ Трис-HCl, 5 мМ DTT, pH 8 (образец / буфер 1:10 (об. / Об.) Или 10 мкл для E.coli , эксперимент, 1 мкг) и обрабатывали ультразвуком в течение 10 ( E.coli , HeLa) или 15 ( B. cereus , ткань легкого мыши) 30 секунд при высоком уровне интенсивности и 4 ° C с использованием Bioruptor ^® Plus (Diagenode, Льеж, Бельгия). Далее образцы инкубировали в течение 1 часа при 37 ° C и осветляли центрифугированием при 16000 x g в течение 5 минут.ИУК добавляли до конечной концентрации 15 мМ, и образцы алкилировали в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. Мочевину разбавляли 50 мМ трис-HCl (pH 8) до 1 М, добавляли трипсин Gold, Mass Spectrometry Grade (Promega, Fitchburg, WI, USA) при соотношении белок / фермент 50: 1, и белки расщепляли в течение 20 часов. при 37 ° С.

Измерения флуоресценции триптофана

Концентрации белка определяли путем измерения флуоресценции триптофана при длине волны излучения 350 нм с использованием 295 нм для возбуждения с помощью микропланшетного ридера Infinite ^® M1000 PRO (Tecan, Maennedorf, Швейцария) ¹³ .Содержание триптофана в каждом образце определяли с использованием стандартной кривой в диапазоне от 0,1 до 0,9 мкг триптофана и предполагая массовое содержание триптофана в образцах 1,3%. Далее переваривали 20 мкг белка каждого типа образца, за исключением эксперимента E.coli с низким исходным количеством ( E.coli 1 мкг). Следовательно, содержание белка в суспензии клеток определяли после лизиса на основе TFA, и клетки из объема суспензии, эквивалентного 1 мкг белка, отбирали на аликвоты и осаждали.

Измерения мутности

Мутность SPEED-лизатов измеряли при 360 нм с использованием спектрофотометра GENESYS ™ 10S UV-Vis (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Ma, USA). Если исходная концентрация белка была выше 1 мкг / мкл, образцы разбавляли смесью 10: 1 (об. / Об.) 2M TrisBase и TFA. Концентрации белка рассчитывались с использованием соотношения 1 AU = 0,79 мкг / мкл. Для экспериментов по анализу процесса пищеварения с помощью мониторинга в реальном времени использовали микропланшетный ридер Infinite ^® M1000 PRO (Tecan, Maennedorf, Швейцария).Устройство для чтения микропланшетов доводили до 37 ° C, и мутность измеряли при 360 нм каждые 5 минут.

Обессоливание пептидов

Пептиды, полученные с использованием FASP, SPEED и Urea-ISD, были обессолены с использованием 200 мкл наконечников StageTips, упакованных с тремя дисками Empore ™ SPE C18 (3M Purification, Inc., Лексингтон, США) согласно Rappsilber et al. ²¹ и концентрировали с помощью вакуумного концентратора. Образцы ресуспендировали в 20 мкл 0,1% муравьиной кислоты, и количество пептидов определяли путем измерения оптической плотности при 280 нм с использованием Nanodrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Рокфорд, Иллинойс, США).

Жидкостная хроматография и масс-спектрометрия

Пептиды анализировали на EASY-nanoLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Бремен, Германия), подключенном к масс-спектрометру Q Exactive ™ Plus (Thermo Fisher Scientific, Бремен, Германия). 1 мкг пептидов разделяли на колонке Acclaim ™ PepMap ™ 50 см (внутренний диаметр 75 мкм, C18, 100 Å, 2 мкм; Thermo Fisher Scientific, Бремен, Германия) с использованием линейного 120 ( E.coli, B. cereus ) или 180 (HeLa, ткань легкого мыши) мин градиент от 3 до 28% ацетонитрила в 0.1% муравьиная кислота при расходе 200 нл / мин. Температуру колонки поддерживали на уровне 40 ° C с использованием нагревателя-бабочки (Phoenix S&T, Честер, Пенсильвания, США). Q Exactive ™ Plus работал в зависимости от данных в диапазоне m / z от 300 до 1650. Спектры полного сканирования были записаны с разрешением 70 000 с использованием целевого значения автоматической регулировки усиления (AGC) 3 × 10 ⁶ с максимальным временем инжекции 20 мс. До 10 наиболее интенсивных 2 ⁺ — 5 ⁺ заряженных ионов были выбраны для диссоциации c-ловушкой с более высокой энергией (HCD) с нормированной энергией столкновения (NCE) 25%.Спектры фрагментов регистрировались при ширине изоляции 2 Th и разрешении 17 500 @ 200 м / z с использованием целевого значения AGC 1 × 10 ⁵ с максимальным временем инжекции 50 мс. Минимальное целевое значение MS² было установлено на 1 × 10 ⁴ . После фрагментации пики динамически исключались из выбора предшественников в течение 30 с в пределах окна 10 ppm. Пептиды ионизировали электрораспылением с эмиттером из нержавеющей стали I.D. 30 мкм (Proxeon, Odense, Дания) при напряжении распыления 2,0 кВ и температуре нагретого капилляра 275 ° C.

Анализ данных

Масс-спектры анализировали с помощью MaxQuant (версия 1.5.1.2) ²² . Сначала массы родительских ионов были повторно откалиброваны с использованием опции «программная фиксация массы» перед поиском спектров MS² с использованием алгоритма Андромеды по последовательностям из полных протеомов либо homo sapiens (UP000005640), либо E.coli K-12 (UP000000625), штамм B.cereus ATCC 10987 (UP000002527) или mus musculus (UP000000589), которые были загружены с UniProt.Спектры исследовали с допуском 4,5 частей на миллион в MS ¹ и 20 частей на миллион в режиме HCD MS², строгой специфичности трипсина (KR, а не P) и с учетом до двух пропущенных сайтов расщепления. Карбамидометилирование цистеина было установлено как фиксированная модификация, а окисление метионина, а также N-концевое ацетилирование белков — как переменные модификации. Уровень ложного обнаружения (FDR) был установлен на 1% для идентификации пептидов и белков. Зависимые пептиды с ранее не рассмотренными модификациями были идентифицированы также с использованием 1% FDR.Идентификаторы переносились между образцами с использованием опции «совпадение между прогонами» в пределах окна совпадения 0,7 мин и окна выравнивания 20 мин. Интенсивность белка для количественного определения без метки (LFQ) рассчитывалась отдельно для каждого метода подготовки образца. Анализ повторяли один раз для каждого эксперимента, обеспечивая полеспецифическое триптическое расщепление на N-концах пептида.

Анализ результатов MaxQuant был выполнен в Persues (версия 1.5.0.31) ²³ . Сначала были удалены обратные попадания, загрязнители и белки, идентифицированные только по месту.Затем параметры, связанные с белками (идентифицированные белки, количественно определенные белки, коэффициенты корреляции Пирсона, коэффициенты вариации), параметры, связанные с пептидами (идентифицированные пептиды, количественно определенные пептиды, пропущенные сайты расщепления, пептиды ragged-N, модифицированные пептиды (C, oxM)) и зависимый пептид. связанные параметры (распределение модификаций пептидов, связанных с пробоподготовкой) были извлечены из соответствующих файлов .txt. Для количественной оценки учитывались только пептиды и белки без пропущенных значений.

Протокол лаборатории

Подготовка проб путем простого извлечения и разложения (SPEED)

Реагенты SPEED

• Трифторуксусная кислота (TFA) , ≥ 99%

  Внимание : TFA очень коррозийный. Обращаться в вытяжном шкафу с соответствующими средствами индивидуальной защиты !!!

• Буфер для нейтрализации: 2M TrisBase в H ₂ O (12,1 г / 50 мл)

  (pH не следует регулировать!)

• Раствор для восстановления / алкилирования (10x): 100 мМ Трис (2-карбоксиэтил) фосфин (TCEP, 29 мг / мл), 400 мМ 2-хлорацетамид (CAA, 37 мг / мл) в H ₂ O

  (Подготовьте свежий перед использованием.Взвешенные аликвоты TCEP и CAA могут храниться при 4 ° C)

• Буфер для разведения образцов: 10: 1 (об. / Об.) Смесь 2M TrisBase и TFA

• H ₂ O

• Исходный раствор трипсина: 1 мкг / мкл трипсина в 50 мМ уксусной кислоте (например, Gold, Mass Spectrometry Grade, Promega)

Оборудование

SPEED

• Наконечники для пипеток

  9010 TFA, e.грамм. epT.I.P.S. от Eppendorf)

• Пробирки для микроцентрифуги (1,5 мл)

  (должны быть устойчивы к TFA, например epT.IPS от Eppendorf)

• ThermoMixer

• 4 9007 Ватт

  (требуется только для определенных типов образцов)

• УФ-видимый спектрофотометр

• Одноразовые УФ-кюветы (75-1500 мкл)

Протокол

1. Lyse

   Ткань / клетки (образец: TFA ~ 1: 4 — 1: 8 (об. / Об.)) В течение 2–10 мин при комнатной температуре.

   Образец следует время от времени перемешивать.Обычно лизис клеток занимает 2-3 мин, а лизис ткани — до 10 мин. Белки стабильны в TFA не менее 1 часа (время инкубации больше не проверялось). Лизис завершается, когда все клетки / ткань растворяются и ДНК полностью разлагается (вязкость подобна воде).

   1. Для эффективного лизиса грамположительным бактериям требуется микроволновое облучение в течение 10 с при мощности 800 Вт.

   2. Из соображений безопасности микроцентрифужные пробирки запечатаны в пробирку Falcon на 50 мл, чтобы предотвратить утечку TFA, если микроцентрифужная пробирка может быть повреждена в микроволновой печи.

   3. Образцы следует нейтрализовать сразу после микроволнового облучения.

2. Добавьте буфер нейтрализации (10-кратный объем TFA (шаг 1))

   pH должен быть ~ 8-9. Образцы нагреваются (экзотермическая нейтрализация) и становятся мутными (осаждаются белки).

3. Добавьте буфер восстановления / алкилирования (1,1 x объем TFA (шаг 1))

4. Инкубируйте при 95 ° C в течение 5 минут

   Образцы можно хранить при -20 или -80 ° C несколько раз. месяцев

5. Определите концентрацию белка с помощью измерения мутности

   1. Перенесите образцы в одноразовые УФ-кюветы (при необходимости разбавьте буфером для разбавления образцов )

   2. Измерьте поглощение при 360 нм с помощью спектрофотометра UV-VIS

   3. Рассчитайте концентрацию белка (1AU = 0.